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可溶性糖,主要包括葡萄糖、果糖和蔗糖,是决定甜橙果实品质的重要营养成分。果实中积累的可溶性糖是在叶片中经光合作用合成,并由维管束韧皮部运输而来。Sugar transporter是位于细胞膜或亚细胞器膜上跨膜转运糖的载体蛋白,广泛参与糖在源叶的韧皮部装载,库器官处的韧皮部卸载,库组织细胞的糖吸收,和糖的跨液泡膜运输,从而调控植株的糖转运和积累。研究Sugar transporter基因对探讨甜橙的糖转运与分配,调控果实糖积累具有重要意义。本研究针对甜橙果实发育过程中的可溶性糖积累,结合基因系统进化,表达分析,亚细胞定位,酵母功能互补,同位素标记和荧光标记等技术,分离甜橙Sugar transporter基因家族,研究其在果实糖积累中的功能,并探讨相关的调控机制。以期筛选出参与果实糖积累的关键基因,进一步理解果实糖转运和积累机制。主要研究结果如下:(1)甜橙Sugar transporter基因家族克隆和表达分析甜橙基因组中共分离77个Sugar transporter基因,编码3个SUT,58个MST和16个SWEET转运子。甜橙3个SUT成员分别属于SUT1,SUT2和SUT4类型。58个MST可分为7个亚族,其中STP和ERD6L亚族发生基因串联复制,导致家族成员大规模增加。STP亚族成员响应ABA和低温的表达模式,反映其基因串联复制可能与抵御逆境有关。大量Sugar transporter基因在叶片、花、果实和愈伤组织中表达,广泛参与源和库组织的糖转运过程。在果实表达的Sugar transporter基因,大部分随果实糖积累过程上调表达,在果实糖积累中发挥重要作用。(2)甜橙SUT家族功能鉴定和在‘红暗柳’甜橙果实高蔗糖积累中的作用酵母功能互补结果表明Cs SUT1,Cs SUT2和Cs SUT4都具有蔗糖转运活性。使用具有荧光的蔗糖类似物Esculin,证明Cs SUT1是具有转运活性的蔗糖质子同向转运子,p H值为5.0时具有最大转运活性。C14标记蔗糖检测表明Cs SUT4是蔗糖质子同向转运子,对蔗糖和麦芽糖特异运输,p H值为4.0时对蔗糖具有最大转运活性。解偶联剂CCCP和细胞膜质子泵抑制剂钒酸盐明显抑制其转运活性。亚细胞定位结果显示Cs SUT4定位于液泡膜。从蔗糖转运和分配角度,对甜橙芽变‘红暗柳’果实高糖积累机制进行初步探讨。和亲本‘暗柳’相比,‘红暗柳’果实积累更高含量的蔗糖,淀粉积累相应减少。‘红暗柳’源叶Cs SUT1,Cs SUT2和Cs SUT4具有较高表达,促进了蔗糖的韧皮部装载。相应地,‘红暗柳’植株韧皮部运输的蔗糖含量高于‘暗柳’。‘红暗柳’果实Cs SUT2具有较高的表达,促进了蔗糖在果实的韧皮部卸载。‘红暗柳’果肉p H值达到5.8,远高于‘暗柳’的p H值3.8,表明‘红暗柳’果实Cs SUT4转运液泡蔗糖到胞质的活性减弱,蔗糖较多积累在液泡。氧化逆境诱导Cs SUT2表达,说明Cs SUT2在‘红暗柳’果实中的高表达可能与‘红暗柳’果实遭受更强的氧化逆境有关。(3)液泡葡萄糖转运子Cs ERD6L在果实糖积累中的功能与调控机制酵母功能互补表明在果实中表达的Cs STP13是葡萄糖和果糖转运子,负责果实成熟期间质外体单糖的吸收。并建立荧光标记葡萄糖2NBDG检测单糖转运子转运活性的方法。克隆ERD6L亚家族的一个成员Cs ERD6L,在花中表达量最高,在源叶中微弱表达。亚细胞定位结果表明Cs ERD6L蛋白定位于液泡膜。酵母功能互补检测表明Cs ERD6L不能恢复酵母生长。利用2NBDG检测Cs ERD6L转运活性,去除可能的液泡定位序列的Cs ERD6L具有葡萄糖转运活性,其转运不依赖于p H值。超量表达Cs ERD6L的酵母细胞中葡萄糖含量降低,说明Cs ERD6L介导液泡葡萄糖向胞质转运。Cs ERD6L与液泡酸性转化酶Csb Fruct1在果实成熟期间上调表达,负责将液泡内蔗糖水解并运输至胞质参与代谢活动。通过果肉处理,Cs ERD6L启动子驱动报告基因表达和检索基因芯片数据,表明Cs ERD6L受ABA,氧化逆境处理和糖饥饿逆境诱导表达。利用启动子驱动报告基因表达探讨了转录因子调控Cs ERD6L表达的研究,ASR类转录因子Cs ASR和一个MYB转录因子Cs8g12680未转录激活Cs ERD6L表达。Cs ERD6L和Csb Fruct1-2在芽变‘红暗柳’果实高表达,说明‘红暗柳’果实在遭受更强的氧化逆境下,液泡中积累的大量蔗糖,被较多水解为单糖后运输到胞质。综上所述,本研究系统分离了甜橙糖转运基因家族,验证了参与果实糖转运和积累的关键候选基因的功能,并探讨了其调控模式。从糖转运的角度,探讨了SUT家族在‘红暗柳’芽变甜橙果实高蔗糖积累中的作用。首次在多年生木本果树作物中,克隆并验证了在果实发育和逆境下介导液泡葡萄糖输出的单糖转运子Cs ERD6L。这对进一步理解甜橙果实的糖转运和积累机制,改良甜橙果实品质提供了重要的基础。