论文部分内容阅读
面对干旱、冷害、盐渍等不良环境,植物通常会调节自身代谢以应对胁迫,维持自身生长,而蛋白质作为生命的物质基础在这种调节中起到了至关重要的作用。GCN2是真核翻译起始因子eIF2α激酶,可以使eIF2α发生磷酸化,从而对蛋白质合成进行调节。酵母和动物中的研究发现,GCN2参与了多种胁迫应答的调节。在植物中,目前研究发现仅有一个eIF2α激酶--GCN2,推测其在植物应对胁迫的代谢通路中起到了重要作用,然而目前有关植物GCN2的研究仍存在许多未知之谜。目前有关植物GCN2的异源表达、纯化、性质鉴定和抗体制备等研究相对较少,一定程度上制约了植物GCN2的进一步研究。因此,本研究在前期研究基础上克隆了烟草NtGCN2(GenBank登录号:KJ706220)的N端1-437aa基因序列,构建了重组质粒pCzn1-NtGCN2(1-437aa),并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-Plys中成功表达了 NtGCN2(1-437aa)蛋白。其次,通过包涵体复性和Ni2+-NTA柱层析方法获得了纯化的NtGCN2(1437aa)蛋白质。再次,利用获得纯化蛋白质免疫新西兰大白兔后制备了NtGCN2多克隆抗体,并进行了 western-blot检测。此外,利用纯化的重组蛋白,采用同位素标记的方法对NtGCN2性质进行了体外鉴定。最后,根据酵母双杂交、Co-IP和RNA-seq等研究结果,采用实时荧光定量PCR对NtGCN2的互作蛋白进行了验证。这些结果为进一步研究植物GCN2的功能及其在逆境胁迫应答中的作用奠定了基础。研究的主要结果如下:首先,基于NtGCN2的全长序列的结构域分析,根据N端的(1-437aa)序列设计引物从前期构建的pMD-NtGCN2载体上克隆了 N端(1-437aa)片段,将该片段插入pCzn1载体中,获得了重组质粒pCzn1-NtGCN2(1-437aa)。将该载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)Plys中,采用0.5mM的IPTG于37℃下诱导表达4小时,SDS-PAGE检测发现目的蛋白NtGCN2(1-437aa)主要存在于沉淀中。另外,在前期研究中,本研究组对NtGCN2的全长蛋白也进行了原核表达表达,SDS-PAGE检测发现目的蛋白主要存在于大肠杆菌BL21-(DE3)-RIPL的全蛋白上清液中。其次,通过包涵体复性和Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱对表达的蛋白质进行了纯化,获得了条带单一的NtGCN2(1-437aa)和NtGCN2全长蛋白。将获得的蛋白免疫新西兰白兔后获得了 NtGCN2多克隆抗体。ELISA结果显示制备的两种抗体效价均为1:520 000。Western-blot检测结果发现制备的NtGCN2(1-437aa)和NtGCN2抗体均可成功检测到重组NtGCN2的表达,然而未能检测到烟草中NtGCN2的表达。我们推测其原因可能是原核表达系统缺乏甲基化、糖基化和其他修饰过程,导致抗原结合位点不能正常呈现而造成的。再次,利用实验室前期制备的NtGCN2(激酶功能域)和NteIF2α纯蛋白,采用同位素标记法对NtGCN2的激酶活性进行了体外鉴定。结果发现NtGCN2可以使其底物NteIF2α发生磷酸化,并且NteIF2α磷酸化水平随着反应体系中NtGCN2浓度增加而增加。时间梯度研究结果表明,NteIF2α的磷酸化水平随着反应时间的延长而增加。该研究结果说明重组蛋白NtGCN2可以在体外使eIF2α磷酸化,表明NtGCN2具有激酶活性。最后,我们根据实验室前期进行的酵母双杂交、Co-IP和RNA-seq数据筛选了 NtGCN2可能的互作蛋白,采用实时荧光定量PCR对NtGCN2互作蛋白进行了验证。结果发现,真核翻译起始因子eIF2α,离子转运相关基因HIPP和光呼吸相关基因PHAO的表达量随着NtGCN2表达量的增加而增加,而mRNA稳定性相关基因CCR4的表达量随着NtGCN2表达量的增加略有下降,活性氧相关基因NQO1的表达量无明显变化。该结果表明NtGCN2可能参与了活性氧清除和光呼吸等代谢过程。此外,在干旱处理下,NtGCN2,eIF2α,HIPP和NQO1基因的表达水平显著增高,其中PHAO的表达量增加约6倍,CCR4表达量的下降程度也表现的更为明显。该研究结果同时也表明,NtGCN2,eIF2α,HIPP,NQO1和CCR4等可能协同参与了植物干旱胁迫的调节。推测NtGCN2可能通过调节植物体内的蛋白质合成、mRNA含量、离子传递效率和氧化还原状态等参与了烟草对干旱胁迫应答,这些研究为梳理植物GCN2参与的胁迫调节网络奠定了基础。