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目的:鼠疫耶尔森氏菌是一类引起人与动物鼠疫的革兰氏阴性菌,其自然宿主是啮齿类动物。它能够利用抗原呈递细胞(抗原presenting cells, APCs)的捕获,转移到淋巴结,引起淋巴结鼠疫。但是APCs最初如何捕捉鼠疫菌仍然未知。由于近来发现的C型凝集素受体与某些革兰氏阴性菌的核心脂多糖(核心LPS)有作用。因此,我们推测鼠疫菌也是通过某种C型凝集素进入到APCs的,例如巨噬细胞。本次实验将对这个机制加以验证,并找到相应的配体和受体。方法:1通过转染,建立稳定表达小鼠C型凝集素受体的细胞株。含有5种C型凝集素受体cDNA保存在表达载体pcDNA3.1中,转染至CHO细胞株,得到CHO-mDC-SIGN、CHO-mSIGN-R1、CHO-mSIGN-R3、CHO-mDEC-205 (CD205)和CHO-mLangerin (CD207)转染株,经过长时间G418筛选,找到能稳定表达的单克隆株,并用流式细胞仪检测。2构建鼠疫菌的光滑型和深度粗糙型。野生鼠疫菌是粗糙型,核心脂多糖暴露在最外面。用自杀质粒同源重组的方法缺失编码核心脂多糖起始位的糖基转移酶,将阻断核心脂多糖的表达,得到鼠疫菌深度粗糙型。在核心脂多糖外侧表达O-抗原将得到光滑型。3粘附和侵袭实验细胞悬浮于含2%FBS的RPMI,以4 x105/ml铺在96或24孔平板中。按照1:50体积加入浓度为1 x 107CFU/ml的细菌。在37℃,5% CO2下孵育2.5小时。细胞经过洗涤后用0.5%的saponin裂解,将裂解液稀释后涂在平板上,得到粘附和侵袭细菌的总量。用庆大霉素处理细菌和细胞混合液,能够杀死细胞外的细菌而不透过宿主细胞膜,得到的是侵入细菌的数量。100 ug/ml的庆大霉素作用1小时后洗去抗生素,裂解细胞进行涂菌计数。细菌侵袭的程度以细胞裂解液中细菌的CFU来估算。所有的实验重复3次。4流式细胞仪检测细菌的侵袭能力。细菌在荧光试剂CFDA-SE中染色,洗去多余的染色液后,把标定好的细菌加入到细胞中培养2小时。细胞液经过洗涤除去未结合的细菌后,用2%的多聚甲醛固定。在做流式细胞仪检测前,以1:10加入Trypan blue (0.4%)混匀,室温10分钟以淬灭细胞外细菌的荧光。Trypan blue能阻止荧光但不能透过细胞膜。被摄取细菌的比例以细胞发出的荧光强度来判定,强度越高,细菌被吞噬的程度越高。5外源物质抑制实验加入外源物质包括抗体,甘露糖,低聚糖,肽等来封阻细胞的吞噬作用,验证细菌和细胞相互作用的特异性。6体内吞噬实验向活体小鼠腹腔注射细菌悬液,1.5小时后处死小鼠,提纯腹腔巨噬细胞后按照体外侵袭实验方法进行。结果:鼠疫菌野生型较光滑型和深度粗糙型在体内外具有更高的侵袭巨噬细胞和CHO-SIGN-R1的能力。在五种转染的CHO-C型凝集素细胞中,只有CHO-SIGN-R1获得了吞噬鼠疫菌的能力。这种侵袭现象能够被SIGN-R1的抗体所抑制结论: Murine SIGN-R1是鼠疫耶尔森氏菌在小鼠巨噬细胞上的受体。其识别机理是野生型鼠疫菌天然暴露核心脂多糖部分,能够被小鼠巨噬细胞上的SIGN-R1识别。阻断这种识别作用为我们在预防和治疗鼠疫菌上提供新的思路。