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hCLP46是从MDS-AML病人的CD34+干细胞cDNA文库中筛选出的一个新基因。作为O-葡萄糖基转移酶,Rumi的同源蛋白,hCLP46可能在Notch信号通路中发挥了重要作用。为了对该基因的功能和性质作进一步的研究,我们利用串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)来筛选与hCLP46有相互作用的蛋白。
通过构建哺乳动物表达载体pcDNA4-pZome-1-C-hCLP46,表达的hCLP46与C端的Protein A-CBP串联亲和标签形成融合蛋白。用构建的载体转染293Trex细胞,利用Zeocin筛选得到Tet-on293Trex-hCLP46稳定细胞株。在本论文中,我们对传统TAP方法进行了改造:1)利用交联剂体内交联后,再进行蛋白的串联亲和纯化;2)利用甘氨酸缓冲液来洗脱Protein A上的蛋白复合体,改变了过去一直使用的TEV酶切蛋白标签法。通过本论文改进后的TAP方法,我们检测到七条有差异的蛋白带。经LC-MS质谱鉴定,检索蛋白数据库后,得到了包括钙连结蛋白和蛋白质二硫异构酶在内的一系列蛋白。
在对hCLP46三维结构的初步探索中,本研究在大肠杆菌系统中表达了hCLP46的全厂蛋白和一系列的截短体蛋白。在凝胶层析纯化时,发现蛋白聚合现象,可能与大肠杆菌中缺乏转录后修饰系统有关。重新构建哺乳动物表达载体pcDNA4-hCLP46-tev-myc-his,用构建的载体转染293Trex细胞,并用Zeocin筛选得到稳定细胞株。经亲和层析柱纯化得到了hCLP46-tev-myc-his重组蛋白,为下一步体外测定其葡萄糖基转移酶活性打下基础。并为进一步获得大量有活性的、可溶的、达到能够结晶、高纯度的蛋白提供基础。