前言膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤,术后复发率很高,严重危害人民健康。肿瘤细胞对抗癌药物产生多药耐药(MDR)是公认的导致抗癌药物治疗失败、肿瘤复发的直接原因。目前国外对此方面机制的研究比较多,其中神经酰胺糖基化机制的研究在国内还比较少。神经酰胺(Cer)是细胞膜神经鞘磷脂水解产生的一种脂质分子,作为细胞凋亡过程中的第二信使,已经证实在放射线、热休克、化疗药物等刺激因素诱导下可以介导多种肿瘤细胞凋亡,其中包括膀胱癌。Obeid首先应用细胞外源性Cer诱导体外培养的人白血病细胞凋亡。此后也有实验证明外源性应用细胞膜通透性的Cer可促进线粒体促凋亡因子的释放酶,激活caspases通路,诱导人膀胱癌细胞发生凋亡。然而有趣的是,有学者在对MDR细胞进行研究时发现,外源性的应用细胞膜通透性的Cer不但没有使细胞发生凋亡,反而使细胞加速增殖。Lavie等又在1996年发现耐长春新碱的口腔表皮样癌细胞株KB-V-1中,葡萄糖神经酰胺(GluCer)含量明显增加,而相应敏感的细胞株KB-3-1却没有这种情况。研究发现,在葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)的催化下,UDP-glucose上的糖基以β型糖苷键与Cer结合而生成GluCer,而GluCer在细胞内的作用恰好与神经酰胺相反,可以促进细胞增殖。进一步研究表明：使Cer糖基化转变为GluCer是MDR细胞的一种普遍现象。美国的Cabot实验室进行乳腺癌的相关研究已经表明：MDR细胞内葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)活性增加,可以将Cer转变为葡萄糖神经酰胺(GluCer),降低抗癌药物的治疗效果。如果抑制MDR细胞Cer糖基化过程,就有可能逆转肿瘤细胞MDR。到目前为止,在泌尿系统,该领域的研究还不十分清楚。目的我们应用转基因技术,将GCS基因导入膀胱癌细胞中并进行SiRNA干扰,检测葡萄糖神经酰胺(GluCer)的表达水平及经化疗药物处理后相应指标,用统计学方法分析二者之间的相关性,从而揭示神经酰胺糖基化与膀胱癌MDR的内在关系,为治疗膀胱癌MDR提供新的思路。方法一、实验材料(一)主要试剂：人膀胱癌细胞系T-24,购自中国上海细胞所细胞库；兔抗人GCS多克隆抗体(Imgenex公司产品),辣根过氧化物酶标记的二抗,PBS液,DAB,苏木素,封闭用蛋白质干粉,TMB膜用单相显色液,Genefinder核酸染料(Takara公司),Thermo Script RT-PCR Syst试剂盒(Invitrogen公司),Caspase-3比色试剂盒(BioVision公司),QIA quick胶回收试剂盒(QIAGEN公司),质粒提取试剂盒,DNA快速连接试剂盒,TRizol试剂盒,MTT试剂盒,Lipofectamine 2000转染试剂盒(Invitrogen公司),质粒pcDNA3.1(+) (Invitrogen公司),GCS SiRNA由Invitrogen公司合成,EXTAQ酶(Takara公司),GCS引物,LB培养基,DMEM培养基等。(二)主要仪器：冰冻切片机,-80℃深冻冰箱,4℃冰箱,组织匀浆机,台式离心机,高速冷冻离心机,多功能电泳仪,成像分析仪,紫外分光仪,医学图像分析系统,GeneAmp PCR System 9700扩增仪(PE公司),超净工作台,CO2培养箱,倒置显微镜等。二、实验方法1、膀胱癌组织及其周围正常组织胞膜中GCS的表达。收集中国医科大学第一临床学院浅表性膀胱癌而行膀胱部分切除或行TURB切除的标本50例及因前列腺增生行切除术之正常膀胱组织标本20例(所有病例标本术前均征得病人及家属同意)。所有病例均经病理证实。其中男性39例,女性11例,年龄在33-75岁,平均为59.5岁。其中22例复发(随访2年),并据此将膀胱癌标本分为两组：复发组和未复发组。采用免疫组化及Western Blot技术检测GCS在膀胱癌肿瘤组织和正常组织中的表达。2、细胞培养细胞置于37℃,饱和湿度,含5%CO2的孵箱中培养,培养液为含有10%新生小牛血清的RPMI1640,每2-3天传代一次,取对数生长期的细胞进行实验。3、构建pcDNA3.1-His-asGCS的基因真核表达载体。4、基因转染培养T-24细胞以pcDNA3.1-His-asGCS表达载体作为目的基因,依据Genebank记载的人GCS基因序列,设计引物,应用PCR技术,扩增GCS基因,修饰后将其重组到真核表达载体pcDNA3.1的EcoR I和Xho l位点之间,构建重组质粒pcDNA3.1 (+)/GCS。应用脂质体Lipofectamin2000将其转染到培养的膀胱癌细胞株。5、pcDNA3.1 (+)/GCS细胞株的筛选建立与鉴定筛选后建立稳定高表达的细胞株。通过免疫荧光法检测转染效率,得到GCS高表达的细胞株。(1)荧光倒置显微镜观察细胞内绿色荧光蛋白的稳定表达；(2)收集细胞进行Western Blot、RT-PCR检测GCS表达；(3)GCS转染前后Bcl-2蛋白含量变化及相关指标。6、阿霉素化疗药物针对各组细胞株的细胞存活率(MTT法)、以及Bcl-2蛋白MDR1含量变化(Western Blot检测),比较各组之间的差异。7、RNA干扰转染GCS高表达的膀胱癌耐药株后,检测其相关的细胞凋亡指标,比较干扰前后的差异。8.统计学分析所有计量资料以x±SD表示,采取多因素方差分析统计学方法,所有数据采用SPSS11.5软件包进行处理,取p<0.05具有统计学意义。计数资料采用Fisher确切概率法或PearsonX2检验法进行统计学分析。结果1、免疫组化SP法及Western blot半定量分析GCS在膀胱癌(复发组、未复发组)及正常膀胱组织中的表达及其差异：各组均有表达,但各组之间差异显著,GCS在膀胱癌中的表达明显高于正常组织中的表达,并且GCS在膀胱癌复发组的表达明显高于未复发组组织中的表达。2、膀胱癌细胞培养结果(T24)。3、构建pcDNA3.1-His-asGCS正义GCS的基因真核表达载体。4、真核表达载体通过脂质体转染后标签绿色荧光蛋白表达,证明构建的载体已经成功转染至细胞株。5、从RNA及蛋白水平(RT-PCR, Western-blotting)检测细胞株在转染前后GCS在转录水平和蛋白表达水平上有显著差异,转染前GCS在细胞株中也有转录和翻译,但明显低于转染后细胞系。6、检测阿霉素化疗药物针对各组细胞株的细胞存活率(MTF法)发现转染GCS以后细胞存活率明显升高,是未转染细胞的2.06倍。Bcl-2蛋白含量变化(Western Blot检测),比较各组之间的差异。GCS转染前后Bcl-2蛋白含量变化及相关指标：转染后细胞系Bcl-2蛋白含量明显高于转染前细胞系。7、RNA干扰转染后GCS高表达的膀胱癌耐药株,检测其相关的细胞凋亡指标,比较干扰前各种凋亡指标明显增加。结论1、GCS与膀胱癌的发生、发展及预后有关系。2、GCS基因可被成功转染入人膀胱癌细胞并稳定表达。3、膀胱癌细胞株在转染前后GCS在转录水平和蛋白表达水平上有显著差异,转染前GCS在膀胱癌细胞株中也有转录和翻译,但明显低于转染后细胞系。4、GCS的高表达可以显著提高神经酰胺的糖基化水平,从而增强肿瘤细胞的耐药性。5、促凋亡药物处理后,转染GCS基因的膀胱癌细胞(耐药组)的耐药性明显增强。6、神经酰胺糖基化机制是导致膀胱肿瘤细胞对抗癌药物产生多药耐药(MDR)的重要因素。7、RNA干扰可以逆转人膀胱癌对于阿霉素耐药。