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细胞自噬是一类依赖于溶酶体和液泡的降解途径,在真核生物中高度保守。植物细胞自噬发生时,首先在自噬相关蛋白的催化作用下,细胞内形成包裹靶物质的双层膜结构的自噬小体,再进一步将自噬小体运送到液泡内进行降解,产生新的小分子以供机体重新利用。在营养物质缺乏、干旱、高盐等非生物胁迫以及病原菌入侵等生物胁迫下,植物可以通过自噬这一高度精细复杂的降解机制回收细胞内的大分子物质和损坏的细胞器以维持自身的正常生长、发育和生存。自噬能诱导酵母细胞液泡酸化,以维持自噬小体降解所需水解酶的活性。与酵母类似,植物囊泡H~+-ATPase(V-ATPase)是一类定位在液泡膜和分泌膜系统上的质子泵,其主要功能是利用催化ATP水解产生的能量向液泡内转运氢离子,使液泡酸化。研究表明,V-ATPase特异性抑制剂ConcanamycinA(ConcA)能抑制内吞转运、分泌途径以及自噬小体的降解,暗示了V-ATPase在植物自噬过程中起着非常重要的作用。拟南芥V-ATPase是由12个亚基组成的复合体,但目前对于单个亚基在自噬中的生理生化功能仍不清楚。拟南芥V-ATPase亚基C(AtVHA-C)由单基因编码,其点突变体det3-1的TGN/EE酸化能力变弱,TGN到液泡的转运速率变缓,但高尔基体和液泡的酸化能力不受影响。我们前期的研究发现,AtVHA-C缺陷型突变体det3-1可能也是一个自噬缺陷型突变体。因此,本文系统研究了AtVHA-C的组织表达模式、亚细胞定位,以及突变体det3-1在碳饥饿和氮饥饿环境下的生理功能和作用机理,旨在揭示V-ATPase亚基C参与植物自噬的功能,并获得以下结果:1.RT-PCR和GUS组织定位染色结果表明,AtVHA-C在拟南芥幼苗、下胚轴、叶片、花以及果荚中普遍表达。烟草叶片细胞瞬时表达结果显示,AtVHA-C主要定位在膜、微丝、细胞核。2.与野生型相比,突变体对于氮饥饿和碳饥饿更加敏感。氮饥饿处理后,det3-1叶片细胞死亡严重,叶片中ROS积累;碳饥饿处理后,det3-1全部死亡,det3-1四周龄苗黑暗处理3 d时ROS开始积累。3.与野生型相比,突变体中自噬小体的形成和转运过程被显著影响。蛋白质免疫印迹(Western Blot)结果显示,氮饥饿处理后,det3-1中ATG8蛋白呈先增后减趋势。氮饥饿处理16 h后,用转盘式激光共聚焦活细胞成像系统(Spin Disc)检测ATG8e-GFP/det3-1中自噬小体的形成情况,结果表明det3-1根成熟区自噬小体数目与野生型中接近,但是加入ConcA后det3-1根成熟区自噬小体比野生型中少。将ATG8e-GFP/det3-1氮饥饿处理0 d、1 d、2 d后,Western Blot检测ATG8e-GFP融合蛋白和游离GFP蛋白的变化情况,结果显示,氮饥饿处理后det3-1中游离GFP蛋白含量基本保持不变。碳饥饿处理后,det3-1根成熟区中自噬小体的数目是野生型中的0.5倍,加入ConcA后det3-1根成熟区自噬小体数目与野生型中的接近。黑暗处理后det3-1中ATG8蛋白含量变化趋势与野生型接近。4.突变体中自噬相关基因和潜在的自噬通路相关基因表达量被显著改变。将det3-1氮饥饿处理0 d、2 d后提取RNA,反转录后进行qRT-PCR检测自噬相关基因以及一些可能与自噬通路相关基因的表达情况,发现氮饥饿除了影响自噬相关基因ATG2、ATG8a、ATG18a的表达,乙烯合成相关基因ACS2、ACS8和ABA相关基因SAG113的表达也受到影响。用外源脱落酸(ABA)和乙烯合成前体物质ACC处理,结果显示det3-1子叶绿化受到ABA影响,但ACC对det3-1的萌发,子叶绿化和根长都没有影响。综上所述,本研究利用细胞生物学、分子生物学的方法,探究了氮饥饿和碳饥饿对拟南芥det3-1突变体蛋白水平和转录水平的影响,确定det3-1为自噬缺陷型突变体。为后期深入研究V-ATPase亚基C参与自噬的分子机制奠定了基础,为全面认知自噬机制和V-ATPase的生理功能提供了新思路与理论依据。