急性肾损伤(acute kidney injury,AlKI)是以多种原因引起的肾功能急剧下降及代谢废物蓄积为特征的一种临床综合征,具有高发病率、高死亡率的特点,已成为全球性公共健康问题。由于肾血管闭塞、肾移植手术等带来的肾缺血再灌注损伤(renal ischemia/reperfusion injury,IRI)是引起急性肾损伤的重要原因之一。尽管近年来有关肾缺血再灌注诱导的急性肾损伤发生发展的研究已经取得了一定的进展,但迄今为止,其病理生理机制尚未完全阐明。除血液置换疗法外,临床亦缺乏满意的治疗方案。因此,研究急性肾损伤相关的新型关键分子及其作用机制,并在此基础上探索新的预防和治疗策略,将具有重要的学术意义和潜在的临床应用价值。二酰甘油激酶(diacylglycerol kinase,DGK)是机体内重要的脂质激酶,其功能在于催化二酰甘油(diacylglycerol,DAG)磷酸化为磷脂酸(phosphatidicacid,PA)而降解。二酰基甘油激酶E(DGKE)是DGK家族第Ⅲ亚类中唯一的成员,其结构和底物均有区别于其他成员的特异性。新近临床研究发现,在某些肾脏相关疾病中出现DGKE功能缺失性的基因突变,提示DGIKE已经成为肾脏疾病研究的重要靶标。但目前有关DGKE的报道多集中于临床基因多态性的检测结果,尚无系统的实验研究,尤其是在与肾缺血再灌注等引起的急性肾损伤中的作用未见报道。研究目的本研究中,我们将使用DGKE基因敲入小鼠来研究DGKE在缺血再灌注诱导的急性肾损伤中的作用,并进一步探讨其生物学机制。方法和结果1.DGKE在缺血再灌注诱导的急性肾损伤中的表达变化及细胞定位健康雄性野生型(wild type,WT)C57BL/6J小鼠(8至12周龄),随机分为假手术组(sham)和肾缺血再灌注损伤模型组(IRI)。使用银丝动脉夹夹闭双侧肾蒂阻断肾脏血流,缺血30min后实现再灌注。使用自动生化分析仪测定血清肌酐、尿素氮水平,结合石蜡切片HE染色及损伤相关因子KIM表达情况共同反映模型制备效果。通过实时定量RT-PCR检测组织中的DGKE mRNA水平,并使用蛋白质印迹分析(Western blot)和免疫组织化学的方法检测DGKE的蛋白表达水平,并应用免疫荧光双标的方法对DGKE在肾小管的实质及炎症浸润细胞中进行了共定位。结果显示,肾脏缺血再灌注损伤后,肾功能急剧下降,形态学检查发现大量的肾小管损伤坏死的表征,损伤相关标志物KIM-1的表达升高,说明模型制备成功。与假手术组相比,缺血再灌注损伤模型组小鼠肾组织中DGKE的mRNA及蛋白表达量显著升高。免疫荧光双标的结果显示,DGKE主要定位于近曲小管,远曲小管中也有少量表达,但集合管中未见表达。除此之外,间质浸润的中性粒细胞和巨噬细胞也表达DGKE。体外培养肾脏来源的不同细胞系,结果显示DGKE在肾小管和肾小球的多种细胞中均有表达;使用三种不同的方法模拟体内缺血再灌注损伤,我们发现在缺氧条件下DGKE肾小管上皮细胞(HK-2)中表达增加。2.DGKE在缺血再灌注诱导的急性肾损伤中的作用为了确证DGKE在缺血再灌注诱导的急性肾损伤中的作用,本课题使用DGKE基因敲入(knockin,KI)小鼠(DGKEk1)建立实验性肾缺血再灌注损伤模型。结果显示,与野生(WT)对照组小鼠相比,缺血再灌注损伤后DGKEkI组小鼠血肌酐、尿素氮水平显著降低。HE检查结果显示,DGKEkI组小鼠的肾小管数量及形态变化均较野生对照组有明显的改善。肾组织切片染色结果显示过表达DGKE后缺血再灌注组小鼠肾组织中凋亡细胞数和KIM-1表达水平等指标明显低于对照组。实时定量聚合酶链反应和免疫组织化学的结果表明DGKEI小鼠肾组织中促炎细胞因子表达及浸润的中性粒细胞和巨噬细胞显著减少,表明过表达DGKE可显著减轻缺血再灌注诱导的急性肾损伤后肾脏中的炎症反应。以上结果说明DGKE在缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤中发挥保护作用。3.DGKE在缺血再灌注诱导的急性肾损伤中保护作用的机制通过基因芯片技术筛选DGKE发挥作用的下游基因,进一步使用RT-PCR、蛋白质印迹和免疫组织化学方法,我们发现在缺血再灌注损伤的条件下,野生对照组小鼠肾脏中klotho的mRNA水平和蛋白质水平均显著低于假手术组,而DGKEkI小鼠肾脏中klotho的表达水平较野生组动物有明显恢复,说明DGKE在缺血再灌注诱导的急性肾损伤中的保护作用可能与上调的klotho表达有关。结论及创新性综上所述,本研究课题首次提出DGKE在缺血再灌注损伤引起的急性肾损伤中发挥保护作用,该作用的发挥可能是通过调控klotho的表达而实现。我们的研究结果有助于更好地了解DGKE在肾脏疾病中的生物学功能,并为临床寻找针对缺血再灌注诱导的急性肾损伤的有效干预策略提供新的思路。