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第一部分: Smad4低表达对H9C2心肌细胞心脏发育相关转录因子表达及其组蛋白乙酰化修饰的影响目的构建Smad4低表达的细胞模型,检测Smad4对心脏核心转录因子GATA4,MEF2c,Tbx5,Nkx2.5的表达的影响,并检测其对组蛋白H3乙酰化及这些基因启动子区组蛋白H3乙酰化水平的影响。以证实我们的科学假设:Smad4对组蛋白乙酰化修饰具有调节作用。方法:(1)构建3条低表达Smad4的慢病毒载体,转染H9C2心肌细胞建立Smad4干扰的稳转细胞株,然后从蛋白水平检测Smad4蛋白的表达,检测其干扰效果,筛选出干扰效果最好的细胞株进行后续试验。(2)实验分为正常对照组,阴性对照组(空载慢病毒组)和Smad4干扰组,实时荧光定量PCR检测三组心脏发育相关基因GATA4,NKX2.5,MEF2c,Tbx5,以及组蛋白乙酰化酶(HATs)亚型p300和GCN5的mRNA表达情况,Western-blotting检测乙酰化组蛋白H3(acH3)的表达, ChIP-Real-Time Q-PCR检测各处理组细胞GATA4,Nkx2.5,MEF2c,Tbx5启动子区组蛋白H3乙酰化水平。结果(1)用第2条干扰序列包装成的Smad4干扰慢病毒转染H9C2心肌细胞以后,Smad4蛋白表达水平明显下降,抑制率为86.8%。(2)与正常对照组及阴性对照组相比,Smad4干扰组的心脏核心转录因子GATA4,Nkx2.5表达降低(P<0.05),MEF2c,Tbx5以及HATs亚型p300和GCN5的表达无明显变化。(3)与对照组相比,Smad4干扰组心脏核心转录因子GATA4,Nkx2.5启动子区组蛋白H3乙酰化水平降低,MEF2c,Tbx5无明显变化。Smad4干扰组心肌细胞总体的组蛋白H3乙酰化水平无明显变化。结论(1)成功构建了针对H9C2心肌细胞中干扰Smad4基因表达的慢病毒载体,为后续试验中验证Smad4的关键作用奠定基础。(2)GATA4和Nkx2.5启动子区组蛋白H3乙酰化水平降低可能导致GATA4和Nkx2.5的mRNA表达下降,而Smad4表达水平降低可能是导致GATA4,Nkx2.5启动子区乙酰化水平降低的机制之一。第二部分:Smad4介导BMP2信号通路对心肌细胞组蛋白乙酰化修饰的调控作用及其机制研究目的在阻断Smad4基因表达的基础上,激活其上游的信号分子BMP2,观察BMP2对下游心脏发育相关基因及乙酰化水平的影响,从而验证我们的科学假说:Smad4介导了BMP2对心脏发育相关组蛋白乙酰化修饰的调节作用。方法(1)用腺病毒AdBMP2转染H9c2心肌细胞24h,48h,72h后,检测BMP2下游基因GATA4,Nkx2.5的表达,筛选合适的作用时间点。(2)选择好合适的时间点后,用腺病毒AdBMP2和AdGFP分别转染H9c2空白组(Blank组),阴性对照组(NC组)以及Smad4干扰慢病毒组(Lv-Smad4组),检测心脏核心转录因子GATA4,MEF2c,Nkx2.5,Tbx5,以及HATs亚型p300,GCN5的mRNA表达情况。(3)检测心肌细胞总的组蛋白H3乙酰化水平。(4)检测心脏核心转录因子GATA4,MEF2c,Nkx2.5,Tbx5启动子区的组蛋白H3的乙酰化水平。结果(1)AdBMP2分别转染H9c2心肌细胞24h、48h、72h后,心脏核心转录因子Nkx2.5和GATA4的mRNA表达水平较对照组明显升高(P<0.05),并于转染后48h达到高峰。(2)在Smad4低表达的心肌细胞中转染AdBMP2后,与单独AdBMP2转染组相比,GATA4,Nkx2.5以及HATs亚型p300的mRNA表达量下降(P<0.05),而MEF2c,Tbx5的mRNA表达未受影响。GCN5的mRNA表达水平在各个处理组间无明显变化。(3)AdBMP2处理组可提高心肌细胞总体组蛋白H3乙酰化水平,在Smad4低表达的心肌细胞中转染AdBMP2后,与单独AdBMP2处理组相比总组蛋白H3乙酰化水平下降。(4)AdBMP2转染Smad4低表达后的心肌细胞,与单独AdBMP2处理组相比,GATA4,Nkx2.5的基因启动子区的组蛋白H3乙酰化水平明显下降(P<0.05),MEF2C,Tbx5启动子区组蛋白H3乙酰化水平则无明显差别。结论(1)BMP2可促进心脏发育相关转录因子GATA4,MEF2C,Nkx2.5,Tbx5的mRNA表达量。(2)BMP2可以提高H9c2心肌细胞总的组蛋白H3乙酰化水平,在Smad4低表达以后,BMP2对组蛋白H3乙酰化水平上调作用受到限制,提示在BMP2引起的组蛋白修饰中,Smad4具有关键作用。(3)BMP2可以提高组HATs亚型p300的表达,并且可通过提高GATA4,MEF2c,Nkx2.5,Tbx5启动子区的乙酰化水平从而提高这些基因的表达。而在此基础上将Smad4低表达后,HATs亚型p300,以及GATA4,Nkx2.5基因启动子区组蛋白H3乙酰化水平及其基因的表达水平均较单独AdBMP2处理组均有下降,说明HATs亚型p300可能参与了BMP2对心脏核心转录因子GATA4,Nkx2.5启动子区组蛋白H3乙酰化水平的修饰作用,而Smad4可能介导BMP2对p300的调控作用,而MEF2c,Tbx5的表达水平及乙酰化水平并未受到Smad4低表达的干扰,提示还可能存在其他分子介导这一过程。第三部分Smad4介导TGF-β2信号通路对心肌细胞组蛋白乙酰化修饰的调控作用及其机制研究目的在阻断Smad4基因表达的基础上,激活其上游的信号分子TGF-β2,观察TGF-β2对下游心脏发育相关基因及乙酰化水平的影响,从而验证我们的科学假说:Smad4介导了TGF-β2对心脏发育相关组蛋白乙酰化修饰的调节作用。方法(1)用不同浓度(5μg/L,10μg/L,20μg/L,40μg/L)的人重组转化生长因子rhTGF-β2干预H9C2心肌细胞24h,48h,72h,提取细胞总RNA检测TGF-β2下游基因GATA4,MEF2c的mRNA表达,筛选合适的浓度与时间。(2)用重组生长因子TGF-β2分别干预H9C2空白组,阴性对照组,Smad4干扰组细胞,检测心脏核心转录因子GATA4,MEF2c,Nkx2.5,Tbx5,以及乙酰化酶p300,GCN5的mRNA表达情况。(3)WB方法检测心肌细胞总的组蛋白H3乙酰化水平。(4)染色质免疫沉淀(ChIP)方法检测心脏发育相关转录因子GATA4,MEF2c,Nkx2.5,Tbx5启动子区的组蛋白H3乙酰化水平。结果(1)与对照组相比,经TGF-β2干预后的心肌细胞,GATA4和MEF2c的mRNA表达量明显增加(P<0.05),且在48小时,20μg/L时达到峰值。(2)TGF-β2干预Smad4低表达的H9c2心肌细胞后,与单独TGF-β2干预组相比,GATA4,Nkx2.5的mRNA表达量下降(P<0.05),MEF2c的表达在这两组间无明显变化,而Tbx5,乙酰化酶p300和GCN5的mRNA表达水平在各个处理组间均无明显变化。(3)TGF-β2可提高心肌细胞总体组蛋白H3乙酰化水平。经慢病毒Smad4干扰处理后的心肌细胞,再过表达TGF-β2后,与单独TGF-β2处理组相比,心肌细胞总的组蛋白H3乙酰化水平下降。(4)TGF-β2干预Smad4低表达的H9c2心肌细胞后,与单独TGF-β2干预组相比,GATA4,Nkx2.5的基因启动子区的组蛋白H3乙酰化水平明显下降(P<0.05),MEF2c启动子区域乙酰化水平在两组之间差异不大,Tbx5在各组间的表达没有变化。结论(1)TGF-β2可促进心脏发育相关转录因子GATA4,MEF2C,Nkx2.5的表达,对Tbx5及乙酰化酶p300,GCN5表达没有影响。(2)TGF-β2可以提高细胞总体组蛋白H3乙酰化水平,但用TGF-β2处理Smad4低表达的细胞后,总的组蛋白H3乙酰化水平不再升高,提示在TGF-β2参与的组蛋白修饰中Smad4起到了关键作用。(3)TGF-β2通过提高GATA4,MEF2c,Nkx2.5启动子区的组蛋白H3乙酰化水平从而提高这些基因的表达,但是TGF-β2引起的GATA4,Nkx2.5启动子区组蛋白H3高乙酰化作用可被Smad4基因干扰所阻断,而MEF2c则不受影响,提示Smad4对于TGF-β2诱导的GATA4,Nkx2.5启动子区组蛋白修饰有重要作用,但同时也可能有其他分子参与介导了TGF-β2对MEF2c启动子区组蛋白乙酰化修饰过程。