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德国生理学家Otto.Warburg(O.H.Warburg,1883～1970),早在1924年就提出一个观点,认为癌症的产生是由于细胞糖无氧酵解增强加上氧消耗量降低造成的。这个被称为瓦尔堡(Warburg)假说。
癌细胞生长很快,过快的生长使得细胞经常处于一种缺氧状态,于是癌细胞就“关闭”了需要线粒体的有氧氧化,大部分的能量通过葡萄糖的无氧酵解提供。而当线粒体功能受损后,细胞也会通过增强无氧酵解来提供能量。当发生Warburg效应时,葡萄糖代谢至丙酮酸(pyruvate)后不再通过线粒体的三羧酸循环进行有氧氧化,而是通过乳酸脱氢酶(LDH),转变成乳酸排出细胞。
恶性肿瘤患者普遍存在碳水化合物代谢方面的障碍,主要表现在葡萄糖转化增加和外周组织利用葡萄糖障碍,胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足。肿瘤组织通过糖酵解通路产生大量乳酸,由乳酸生成葡萄糖及糖异生作用增加是肿瘤患者葡萄糖转化增加的主要原因。与线粒体有氧代谢相比,糖酵解代谢是个相对低效率的产能过程。1个分子葡萄糖通过有氧代谢途径净生成38个分子ATP,而1个分子葡萄糖经过糖酵解途径净生成2个分子ATP。因此,需要代谢明显增强的糖酵解才能补充足够能量。肿瘤组织主要是通过糖酵解通路,从而产生大量乳酸,这样进一步增加了宿主的能量消耗。正常人体约有20％的葡萄糖转化是由无氧酵解完成的,但在大部分恶性肿瘤患者中,超过50％的葡萄糖转化是由无氧酵解完成的。此外,恶性肿瘤患者以丙氨酸和甘油为原料的糖异生过程加强,这一过程在恶性肿瘤患者中持续存在,伴有体重下降的恶性肿瘤患者肝脏合成葡萄糖速率比正常人增加40％。除上述糖代谢变化之外,最近的研究还发现肿瘤细胞存在一些无效循环。
代谢改变是细胞对缺氧以及线粒体功能障碍的一种代偿性改变,线粒体功能障碍可能是癌症产生的原因之一,或者也是缺氧状态下的一种改变。恶性肿瘤细胞以葡萄糖酵解为主要、唯一的能量获取方式被认为是恶性肿瘤细胞一个重要特征。肿瘤细胞糖酵解具有重要病理生理学意义。首先,糖酵解为肿瘤细胞提供更多能量。肿瘤细胞除通过线粒体有氧代谢之外尚能在缺氧情况下利用糖酵解提供额外2个ATP。其次,糖酵解启动肿瘤细胞自主营养摄取。正常细胞需外源性刺激信号启动对营养物质的摄取,而糖酵解可直接启动肿瘤细胞对营养物质的摄取并为肿瘤细胞提供自主、直接的营养物质摄取信号。另外,糖酵解还直接促进某些信号因子的表达,这些信号因子通过其下游的信号传导途径促进肿瘤细胞增殖、启动肿瘤血管新生、躲避细胞凋亡程序等,同时也能够反过来直接促进肿瘤细胞糖酵解。Warburg效应不仅仅局限在癌细胞,一些其他的人体细胞也存在这个现象,当线粒体功能出现问题后,细胞代偿性地增加无氧酵解,例如糖尿病就存在这种现象。
乳酸脱氢酶(LDH)是一种糖酵解酶。乳酸脱氢酶(LDH)存在于机体所有组织细胞的胞质内。乳酸脱氢酶(LDH)是能催化乳酸脱氢生成丙酮酸的酶,几乎存在于所有组织中。LDH催化丙酮酸向乳酸转化,伴有NADH向NAD+的氧化过程。由于NAD+是GAPDH催化的糖酵解过程中所必需的,通过LDH催化反应再生NAD+对于维持糖酵解过程持续是重要的。
综上所述,肿瘤细胞能量代谢具有以下特点:①肿瘤细胞通过糖酵解获取能量并与恶性程度、浸润和转移能力相关；②肿瘤细胞需要大量葡萄糖供应；③肿瘤细胞的能量代谢具有葡萄糖依赖性:以葡萄糖为唯一的能量底物。乳酸脱氢酶(LDH)在糖酵解与有氧氧化之间的转换过程具有重要作用,在肿瘤发生过程中,糖酵解产物乳酸可以维持高比例ATP/ADP,从而抑制有氧氧化,促进恶性肿瘤的进展,形成恶性循环。
肝癌(liver cancer)是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤,初期症状并不明显,晚期主要表现为肝痛、乏力、消瘦、黄疸、腹水等症状。临床上一般采取西医的手术、放化疗与中药结合疗法,但晚期患者因癌细胞扩散而治愈率较低,因此要做到肝癌的早期发现、早期诊断、早期治疗。
而MicroRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,它们在动植物中参与转录后基因表达调控。到目前为止,在动植物以及病毒中已经发现有数千个microRNA分子。MicroRNA在转录后水平沉默特定基因从而对生物体基因表达起到精细调节的作用。绝大多数microRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成茎环结构,称为初级microRNA(primary miRNA,pri-miRNA)。Pri-miRNA在Drosha-DGCR8复合体的作用下形成前体microRNA(precursor miRNA,pre-miRNA)。pre-miRNA被转运出胞核,在胞浆中剪切成为microRNA复合体,如果microRNA复合物(RNA—induced silencing comlex,RISC)与靶mRNA的3’UTR匹配,则该复合体通过降解mRNA或者抑制靶mRNA的翻译沉默特定基因。
肝癌是一种代谢旺盛的恶性肿瘤,恶性度高。本次实验的主要目的就是通过对能够调控乳酸脱氢酶(LDH)的MicroRNA的筛选,进一步测定在肝癌组织以及细胞中相关MicroRNA的含量推测出能够抑制乳酸脱氢酶(LDH)的MicroRNA,以期为日后的肿瘤治疗提供方向。而在实验中,较为系统的研究了miR-449b在肝细胞肝癌发生发展过程中的功能。对miR-449b的靶基因进行了预测以及鉴定,通过报告基因实验对靶基因进行了分析验证,确认了LDH是miR-449b在肝细胞肝癌发生过程中的直接靶基因。