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马铃薯(Solanumtuberosum L.)是全球继小麦、水稻、玉米之后的第四大粮食作物,由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的晚疫病是马铃薯生产中最为严重的病害。马铃薯进化出两个分支的免疫反应来应对晚疫病原菌的侵染,包括由病原相关分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMPs)激发的 PTI(PAMPs triggered immunity)和由效应子(Effector)引起的 ETI(Effecter triggered immunity),激发一系列抗病反应相关基因来抵抗病原菌的侵染,有时会诱导产生过敏性坏死反应(Hypersensitive response,HR)来抑制病原菌的进一步扩展。本实验室前期克隆到了一个可能与过敏性反应相关的基因StPOTHR1,该基因受晚疫病原菌、机械伤害、盐胁迫和茉莉酸诱导表达,但在马铃薯晚疫病抗性上的作用机制及其与HR的关系尚不明确。本课题研究了StPOTHR 与HR的关系、在晚疫病抗病反应中的作用机制及其介导的免疫信号途径,为马铃薯晚疫病持久抗性育种研究提供了新的思路及潜在的基因资源。主要研究结果如下:1.获得了可以高丰度组成型稳定表达GFP且具有与野生型菌株致病力相当的转基因P.infestans菌株W8-G20,为定性和定量研究马铃薯与晚疫病原菌互作机制提供了直观和简便的技术手段;利用W8-G20接种马铃薯晚疫病水平抗性基因型386209.10和感病基因型鄂马铃薯1号(E1),能够清晰的观察到两个基因型表现出明显不同的发病症状,E1叶片上的荧光强度显著高于386209.10,386209.10可以显著地抑制病原菌的增殖速度,说明抑制病原菌在体内的定殖和扩展可能是水平抗性的一个重要防御机制。2.通过生物信息学分析发现StPOTHR1含有NHL(NDR/HIN1-like)家族的3个保守结构域,属于NHL家族成员。通过系统进化树分析进一步发现,其与NHL基因家族成员NtHIN1和AtNHL3亲缘关系最近,推测其与植物的过敏性反应、抗病性等生物学过程相关。原位杂交(ISH)和qRT-PCR实验表明,在垂直抗性基因型鄂马铃薯3号(E3)与晚疫病致病菌株W8互作产生HR的过程中,StPOTHR1只在过敏性病斑部位大量表达,而在其他位置几乎不能诱导表达,表明StPOTHR1的表达与HR紧密相关,可能是马铃薯抗病反应中的起重要作用的基因。3.通过研究StPOTHR1在马铃薯对晚疫病在亲和互作(感病)、非亲和互作(垂直抗性)以及水平抗性(小种非特异抗性)过程的表达模式,发现StPOTHR1在垂直抗性基因型E3中能迅速响应,并维持在较高的表达水平;而在感病基因型E1中则一直维持在较低的水平,只在后期有上调表达的趋势;在水平抗性基因型386209.10中,表达水平处于则前两者之间。研究结果表明,StPOTHR1基因的表达量与马铃薯的抗性反应发生的强度呈正相关。4.在感病基因型E1中超量表达StPOTHR1,能显著抑制病原菌孢子囊的数量,显著提高植株对晚疫病的抗性,表现出与水平抗性基因型386209.10相似的抗性特征,但在垂直抗性基因型E3中,抑制StPOTHR1的表达不能抑制HR的产生;同时,在本氏烟草(Nicotianabenthamian)中瞬时沉默StPOTHR1的同源基因NbPOTHR1后,不会影响由主效 R/Avr基因(Sto/Ipio、Rvnt-1/Avrvnt-1、Pto/AvrPto、Cf4/Avr4、Cf9/Avr9和R3a/Avr3a)等介导产生的HR,说明StPOTHR1介导的抗性反应可能独立上述己知的R/Avr介导的HR。5.研究主效 R/Avr 基因对(Sto/Ipio、Rvnt-1/Avrvnt-1、Pto/AvrPto、Cf4/Avr4、Cf9/Avr9和R3a/Avr3a)介导的HR过程中POTHR1的表达模式发现,POTHR1只响应特异的R/Avr基因对(Pto/AvrPto)介导的HR;同时其也受到能激活PTI的晚疫病原菌效应子INF1和细菌PAMPs flg22的诱导,并且POTHR1也能调控PTI早期响应marker基因的表达,表明POTHR1可能参与了 PTI和ETI的crosstalk。6.在烟草上瞬时表达GFP-StPOTHR1融合表达载体,发现GFP-StPOTHR1定位于细胞膜上,通过Western Blot证明了该蛋白的完整性,说明GFP-StPOTHR1的定位能准确反应StPOTHR1在植物体内执行功能的位置;同时,我们还发现GFP-StPOTHR1的实际电泳条带大于其理论值,其可能是翻译后修饰所导致,通过利用LC-MS/MS技术,对StPOTHR1的翻译后修饰进行了探究,结果发现StPOTHR1受到多种翻译后修饰调控,GFP-StPOTHR1条带的迁移可能与这些翻译后修饰相关。本研究首次全面地探究了 NHL家族成员StPOTHR1的翻译后修饰位点,对这些位点潜在功能的探究将进一步增强对植物免疫调控的认识。7.通过利用IP-LC-MS/MS分析,筛选到一个植物MAPK级联途径上的可能与StPOTHR1互作的组分NbMKK5L,进一步通过Co-IP确证了 NbMKK5L与StPOTHR1的直接互作,该结果暗示过表达StPOTHR1导致的马铃薯晚疫病抗性的增强可能与激活植物免疫相关的MAPK级联途径相关;本研究构建了StPOTHR1基因原核表达载体并在体外获得了大量纯化活性蛋白,为体外进一步直接研究MKK5L与StPOTHR1间的调控作用,如MKK5L能否直接将StPOTHR1磷酸化等研究提供了基础。