研究背景和目的纳米氧化铈(CNPs)属于镧系金属元素氧化物,其表面同时存在Ce4+和Ce3+的氧化价态且可相互转化,因此具有独特的催化活性及多种生物酶学模仿活性,能有效清除机体内多种活性氧及活性氮,被广泛应用于生物医学领域。然而,未经充分表面修饰的CNPs存在着体内易团聚,易被内皮网状系统(ERS)清除等缺点,从而限制了其临床应用,因此需要对CNPs表面进行生物相容性修饰。然而,大多数表面修饰物如聚乙二醇(PEG)由于缺乏内在亲和力而很难稳定的吸附于CNPs表面。因此,需要寻找一种锚定分子来“桥接”CNPs与表面修饰物,以此探索一种简单、有效的CNPs表面修饰方法。正常生物组织暴露于电离辐射会产生大量自由基,损伤正常细胞及组织。研究报道,CNPs可以有效清除电离辐射诱导产生的多种自由基,降低细胞氧化应激水平,有望成为一种新型的放射防护剂。然而,未经充分表面修饰的CNPs抗辐射活性较低,且副作用较大。因此,有必要评价生物相容性修饰的CNPs对正常细胞的辐射防护作用,积极探索一种新型、有效、副作用小的放射防护剂。光动力学治疗(PDT)是指进入特定组织的光敏剂(PSs)在特定波长光的激发下,与生物分子或氧分子发生光敏作用,产生大量单线态氧(1O2)等活性氧,从而光损伤细胞。作为一种新型非侵袭性治疗手段,PDT具有组织特异性强、副作用小等优点,在治疗良恶性实体瘤及克服肿瘤耐药方面具有其独特的优势。然而,大多数传统的PSs疏水性较高,肿瘤靶向性较弱。CNPs作为PSs的载药平台除具有载药量大,靶向性高,有效提高PSs的生物相容性,药效时间长等一般纳米材料的优点外,其独特的催化活性、协同抗肿瘤效应以及优秀的储氧功能亦可增强PDT效应,因此CNPs-PSs在恶性肿瘤及耐药性肿瘤的PDT治疗中具有巨大的潜力。然而,CNPs在PDT中的应用却很少被研究。因此,设计一种基于CNPs的PSs载药系统用于PDT肿瘤治疗及肿瘤耐药性的克服,并深入研究其机制,以此探索一种基于CNPs的新型、有效、靶向性高、副作用小PDT治疗方案,对指导临床肿瘤PDT的实施具有重要意义。研究方法1、通过微乳液法或高温分解法合成CNPs,并以阿仑膦酸(AL)作为锚定分子,对CNPs表面进行琥珀酸(SA)或PEG修饰;分析修饰前后纳米颗粒的分散性、稳定性、表面电荷分布、SOD酶模仿活性及细胞毒性;测定修饰前后纳米颗粒在小鼠体内的血液循环滞留时间及脏器分布。2、对比研究裸的CNPs及PEG化的CNPs(CNPs-AL-PEG)对60Coγ射线诱导的正常肝细胞增殖活性、细胞凋亡、细胞内ROS浓度、DNA损伤的影响;分析修饰前后纳米颗粒的细胞摄入量、亚细胞定位及对细胞内SOD2蛋白表达的影响。3、通过共价链接将聚乙烯亚胺(PEI)嫁接到CNPs-AL-PEG上(PPCNPs),并将光敏分子二氢卟吩(Ce6)共价键合到PEI氨基末端,合成多功能纳米载药系统(PPCNPs-Ce6);采用稳定性分析、X射线光电能谱(XPS)分析、荧光光谱分析、Zeta电位分析及1O2产生能力分析对材料进行化学表征;对PPCNPs-Ce6的细胞摄入量及亚细胞定位进行分析;通过细胞增殖活性分析、细胞凋亡检测、细胞内ROS浓度测定、溶酶体功能检测及透射电镜观察,研究PPCNPs-Ce6对宫颈癌细胞的黑暗化疗毒性或在660 nm光照条件下的PDT光损伤效应及其机制;采用肿瘤生长曲线及肿瘤及脏器病理研究PPCNPs-Ce6对荷瘤小鼠的光-化疗协同效应。4、在PPCNPs-Ce6的基础上,链接肿瘤靶向性分子叶酸(FA),合成靶向性多功能载药系统(PPCNPs-Ce6/FA);采用透射电镜观察、稳定性分析、XPS分析、荧光光谱分析、红外光谱分析、Zeta电位分析、1O2产生能力分析对材料进行化学表征;通过阿霉素(DOX)摄入量、细胞增殖活性研究及药物外排泵P糖蛋白(P-gp)表达分析,研究基于PPCNPs-Ce6/FA的低剂量PDT对耐药性乳腺癌细胞耐药性的影响;分析PPCNPs-Ce6/FA的细胞摄入量、亚细胞定位及对耐药性乳腺癌细胞的PDT光损伤效应;通过细胞内凋亡相关蛋白Caspase-3/-7酶及自噬相关蛋白LC3-II的表达水平分析、溶酶体膜通透性检测(吖啶橙染色、凝集素穿孔实验)、活细胞成像、透射电镜观察、胞内ATP含量及Ca2+浓度检测,研究基于PPCNPs-Ce6/FA的PDT诱导耐药性乳腺癌细胞死亡的途径;活体动物成像、肿瘤生长曲线及肿瘤病理研究PPCNPs-Ce6/FA对荷瘤小鼠的肿瘤靶向性及PDT抗肿瘤效应;研究尾静脉注射PPCNPs-Ce6/FA对小鼠血常规、肝肾功及脏器病理的影响。研究结果1、CNPs的合成及表面修饰:采用微乳液法及高温分解法合成的CNPs,粒径约为3-5 nm;以AL作为锚定分子,成功将SA及PEG修饰于CNPs表面,修饰后的CNPs分散性及稳定性显著提高;CNPs表面修饰能显著提高纳米颗粒表面Ce3+/Ce4+的比率,且随着修饰链长度的增加而升高,导致其SOD酶模仿活性显著提高,并降低对肝细胞的毒性;CNPs的PEG修饰能显著提高纳米颗粒在体内的血液循环滞留时间,改善组织分布,进而减少其在肝脏特别是脾脏中的蓄积。2、PEG化的CNPs的辐射防护研究:CNPs-AL-PEG具有良好的分散性及稳定性,其表面Ce3+的浓度(46.4%)显著高于裸的CNPs(37.9%);CNPs及CNPs-AL-PEG都能有效降低电离辐射诱导的L-02细胞损伤及凋亡,但CNPs-AL-PEG的辐射保护效应(~86.7%)显著强于CNPs(~62.4%),提示PEG修饰能有效提高CNPs的辐射防护效应;PEG修饰能显著增强CNPs对电离辐射诱导的O2·-等自由基的清除,促进细胞内SOD2酶的表达,从而减轻电离辐射对细胞DNA的损伤;PEG修饰显著降低细胞对CNPs的摄取(约400倍),CNPs-AL-PEG进入细胞后分散于胞浆,而裸的CNPs进入细胞后大量团聚并集聚于溶酶体,这是裸的CNPs毒性较高且放射防护效应较低的主要原因之一。3、PPCNPs-Ce6对宫颈癌的光-化疗协同效应:PPCNPs-Ce6具有良好的稳定性及生物相容性,PSs加载效率较高(质量比Ce6/Ce:~40%);PPCNPs-Ce6显著增加宫颈癌细胞Hela对PSs的摄入(>10倍),并定位于细胞溶酶体;PPCNPs-Ce6能被660 nm近红外激光(NIR)激发而发生光敏反应,超低剂量PPCNPs-Ce6(<1μM)下就能有效光损伤肿瘤细胞,与游离Ce6相比,其PDT效应显著提高;较低剂量PPCNPs-Ce6(3-10μM)在黑暗情况下就能损伤细胞溶酶体,促进细胞ROS的产生,诱导细胞细胞发生凋亡,对肿瘤细胞有显著的化疗毒性;基于PPCNPs-Ce6的同步光-化疗能显著降低抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长(肿瘤抑制率104.7%),可克服传统PDT组织穿透性差的缺点,且无明显毒副作用,实现了成像介导的光-化疗协同治疗宫颈癌。4、PPCNPs-Ce6/FA对耐药性乳腺癌的靶向光敏作用:PPCNPs-Ce6/FA稳定性及生物相容性高,PSs加载效率高;与PPCNPs-Ce6相比,耐药性乳腺癌MCF-7/ADR对PPCNPs-Ce6/FA的摄入进一步提高;PPCNPs-Ce6/FA进入细胞后选择性的定位于溶酶体,且能被660 nm NIR激发,产生大量ROS;基于PPCNPs-Ce6/FA的低剂量PDT能破坏MCF-7/ADR细胞P-gp药物外排泵,促进细胞对DOX的摄入,从而发挥光-化疗协同效应;PPCNPs-Ce6/FA在660 nm光照激发下,超低剂量(<1μM)就能对MCF-7/ADR细胞发挥优异的光损伤效应;基于PPCNPs-Ce6/FA溶酶体靶向的PDT诱导细胞发生凋亡及自噬具有明显的剂量依赖性,光敏化较高浓度的PPCNPs-Ce6/FA(1μM)会诱导细胞发生Oncosis方式的死亡,伴随着细胞溶酶体膜的破坏、胞膜起泡、细胞及细胞器肿胀、胞浆空泡化及能量的快速耗竭;裸鼠荷瘤实验证明PPCNPs-Ce6/FA具有优异的肿瘤靶向性,并能在NIR激发下显著抑制肿瘤的生长(肿瘤抑制率96%),发挥优异的抗肿瘤效应;适当浓度PPCNPs-Ce6/FA静脉全身给药对动物毒性较小,安全性高。主要结论1、以AL作为锚定分子,成功将SA及PEG修饰于CNPs表面,修饰后的纳米颗粒稳定性、生物相容性及SOD酶模仿活性显著提高,细胞毒性显著降低。2、PEG修饰有效改善CNPs的细胞摄取及亚细胞定位,提高纳米颗粒对辐射诱导的ROS的清除能力,促进细胞SOD2的表达,减轻辐射诱导的DNA损伤,从而增强CNPs对细胞的辐射防护效应。3、基于CNPs的纳米载药系统(PPCNPs-Ce6)显著促进宫颈癌细胞对PSs的摄入,并定位于溶酶体,在特定波长光激发下超低剂量就能能有效发挥PDT杀伤肿瘤效应;同时在黑暗情况下,一定浓度PPCNPs-Ce6能有效发挥化疗毒性,从而实现成像介导的光-化疗协同治疗宫颈癌。4、PPCNPs-Ce6/FA进一步增强耐药性乳腺癌对PSs的摄入及光敏效应,基于PPCNPs-Ce6/FA溶酶体靶向的PDT能有效克服肿瘤耐药性,其诱导细胞发生凋亡及自噬具有明显的剂量依赖性,光敏化较高浓度的PPCNPs-Ce6/FA会诱导细胞发生Oncosis。