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研究背景：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种进行性不可逆神经系统变性疾病,是老年痴呆最常见的病因。至今AD的确切病因和发病机制不明,目前已知载脂蛋白Eε4等位基因与迟发性AD相关,早发性家族性AD主要由β-淀粉样前体蛋白(P-amyloid precursor protein, βAPP)、早老素-1(presenilin-1, PS-1)及早老素-2(presenilin-2, PS-2)基因突变引起。目前对于PS-1基因突变如何致病还不清楚,之前的研究认为突变的PS-1通过“获得功能”(gain of function)影响β-淀粉样多肽1-42(Amyloid β1-42,Aβ42)而发病,即淀粉样蛋白级联假说(Amyloid Cascade Hypothesis),该假说认为异常的β淀粉样蛋白(amyloid-P peptides, Aβ)是触发病理级联反应并最终导致AD的第一步。Ap是由正常存在于细胞膜上的APP经p-和γ-分泌酶剪切后产生一系列长度在39～43个氨基酸的短肽,其中,Aβ42最容易聚集纤维化,是主要的致病蛋白。早老素(presenilin, PS)蛋白是γ-分泌酶复合物的活性亚基,如发生突变,可影响APP剪切而导致异常Aβ的产生和聚集。近期的研究发现,某些PS-1基因突变不通过Aβ42致病。因此,需要更多的研究参与阐述PS-1基因突变与AD的关系。目的：通过筛查突变频率最高的PS-1基因突变来观察111例来自浙江大学医学院附属第二医院神经内科住院或门诊被诊断为AD的患者并且未经家族史和发病年龄筛选的情况下PS-1基因的突变情况。筛查发现1例患者PS-1基因3号外显子起始密码子发生了杂合突变ATG→GTG,构建突变型质粒转染细胞观察PS-1起始密码子突变后PS-1和APP的表达变化情况。方法：研究对象共266例包括未经过家族史和发病年龄筛选的111例来自浙江大学医学院附属第二医院神经内科住院或门诊被诊断为AD的患者,5例M766患者亲属,150例正常对照。常规酚/氯仿提取法提取外周血DNA,对PS-1基因13个外显子及侧翼内含子DNA扩增,聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)产物纯化后直接测序分析。利用体外定点突变技术突变野生型PS-1cDNA并构建野生型和突变型PS-1增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)融合基因质粒,通过实时荧光定量PCR检测PS-1和APP基因在人胚胎肾(HEK)293细胞、小鼠成神经瘤细胞N2a中的mRNA表达情况,并通过Western blot技术观察野生型和突变型PS-1蛋白在两个细胞系中的表达变化情况。结果：(1)发现患者M766的PS-1基因3号外显子起始密码子发生了杂合突变ATG→GTG。该患者的发病年龄为57岁。其93岁母亲、63岁的大妹妹和患者的小儿子也检测到同样的突变,但均未发病。同时,发现3个已报道的单核苷酸多态(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)(rs1800839,rs116882898,rs165932)。(2)实时荧光定量PCR检测发现PS-1基因mRNA在HEK293细胞和N2a细胞中野生型均显著高于突变型,APP基因mRNA在两细胞系中未见明显差异。(3)Western blot结果显示野生型和突变型PS-1在HEK293细胞中均表达,且突变型表达量较野生型少。而N2a细胞仅表达野生型PS-1。结论：(1)对未经过家族史和发病年龄筛选的111例来自浙江大学医学院附属第二医院神经内科住院或门诊被诊断为AD的患者行PS-1基因突变筛查未发现新的或已经报道的致病突变,提示PS-1基因突变导致的AD占总AD患者比例较低。(2)根据M766患者家系图显示,未见PS-1基因起始密码子突变和疾病AD共分离现象,推测其可能不是致病突变,而是AD的一个危险因素,也可能是一个SNP。(3)实时荧光定量PCR检测发现PS-1基因mRNA在HEK293细胞和N2a细胞中野生型均显著高于突变型,Western blot技术检测PS-1蛋白表达显示野生型和突变型PS-1在HEK293细胞中均表达,且突变型表达量较野生型少。而N2a细胞仅表达野生型PS-1,提示PS-1基因非ATG起始密码子GTG在HEK293细胞中表达效率降低,而在神经样细胞N2a中可能引起PS-1蛋白不表达。(4)实时荧光定量PCR检测发现APP基因mRNA在两细胞系中未见明显差异,提示PS-1基因起始密码子突变对APP影响不大。