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普瑞巴林是治疗神经性疼痛和癫痫的药物,(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸是制备普瑞巴林的重要手性中间体。生物催化法合成普瑞巴林已成为目前研究和开发的热点,该工艺路线符合绿色化学及可持续发展的要求,具有重要的工业应用价值。本论文对本实验室构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-TLL进行了产酶条件的优化,然后利用重组脂肪酶实现了外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯到(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的转化,建立了一条适于工业化生产的工艺路线,最后进行了年产10吨普瑞巴林关键手性中间体的物料衡算,为普瑞巴林中间体的工业化生产提供了理论基础。以E.coli BL21(DE3)/pET28b-TLL为出发菌株,通过单因素法实验,确定了菌株在5 L发酵罐分批发酵工艺,温度:诱导前37 ℃,诱导后28℃,搅拌转速500r/min,通气量1.5L/min,种龄8h,接种量2%,OD600=7左右加入10g/L乳糖进行诱导,最终得到平均菌体量为8.28 g/LDCW,酶活为252.36 U/L,为分批补料发酵奠定了基础。优化得到5L罐分批补料发酵的工艺。温度:诱导前37℃,12 h后降温至28℃诱导表达14 h。pH值:pH始终控制在7.2,20%氨水自动调节。溶解氧:空气流量设定为1.5 L/min。在整个发酵过程中溶氧控制在50%。搅拌速度:补料开始后,采用溶氧联动搅拌的控制模式。补料策略:补料由溶氧反馈控制,当溶氧高于50%时补加培养基,补料速率为10 mL/min,补料周期为1S/20S。诱导方式:发酵12 h后,降温到28℃,加入乳糖45 g,18 h时再次加入45 g乳糖,使其终浓度为30 g/L。最终得到菌体干重为38.42 g/L,酶活为798.45 U/L。在200 mL转化体系中优化静息细胞催化合成普瑞巴林关键手性中间体的工艺条件,并成功放大到2 L反应体系。工艺参数为:温度:50℃,pH8.0,乙酸钙浓度150mM,菌体浓度75g/L,底物分4次加入,每次600 mM,反应24 h,最终底物的转化率为28.93%,e.e.值 92.59%,时空产率为 8.18g/(L·h)。进行了发酵工段,生物催化工段和脱羧工段生产工艺流程设计,进行了物料衡算,为实现年产10吨普瑞巴林关健手性中间体的生产目标提供了理论依据。