基于微生物分子生态学技术构建水产品中微生物预测模型

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本课题主要是运用real-time PCR绝对定量和16SrDNAPCR-DGGE指纹图谱数字化的方法建立南美白对虾中微生物(单增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、肠炎沙门氏菌、假单胞菌和巨型球菌)的预测模型。首先,在4℃和10℃温度条件下,建立单增李斯特氏菌和副溶血性弧菌在南美白对虾上的预测模型。本实验同时采用了传统的涂布计数法、real-time PCR定量检测方法和DGGE方法,并将传统方法和这两种分子方法所建立的预测进行比较,分析分子生态学建立微生物模型的可行性及可靠性。用统计学方法对单增李斯特氏菌相关系数(R~2)、最大比生长速率(μmax)、延滞期()、最大细胞浓度(A)进行显著性分析,较传统涂布方法与real-time PCR方法所得参数均无显著性差异(P>0.05)。用real-time PCR方法建立副溶血性弧菌预测模型,通过分析主要是因为副溶血性弧菌在低温是呈递减趋势,而在低温条件下副溶血性弧菌会进入活的不可培养状态(VBNC状态),该状态的细菌无法通过传统涂布计数方法计数,然而用real-time PCR方法通过DNA的提取就可以对DNA进行定量,从而得到细菌数量。所以real-time PCR定量方法可以用于建立微生物预测模型。DGGE方法所得数据对单增李斯特氏菌的拟合结果与传统方法相似度和很高,而描述4℃和10℃时副溶血性弧菌的数量变化趋势存在一定偏差。4℃时,传统方法和DGGE方法描述的副溶血性生长趋势是相同的,而10℃时,这两种方法所得的模型趋势不同,这一现象需进一步研究。由于本文是首次提出并运用DGGE方法建立微生物预测,该方法处于起步阶段,存在一定的缺陷,但是由于DGGE一次可以观察多种菌,可以明显看出微生物生长的趋势,在预测微生物领域还是很有发展的潜力。其次,通过上一章的实验结果,得出用分子生态学建立微生物预测模型的可行性。所以,在4℃和10℃温度条件下,用分子生态学建立五株菌(单增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、肠炎沙门氏菌、假单胞菌和巨型球菌)在南美白对虾上的生长的预测模型。real-time PCR定量数据模型拟合结果:4℃和10℃这两个温度下,不同模型对单增李斯特氏菌的拟合相关系数R~2均在0.9以上。4℃和10℃时,只有Baranyi模型适合用于肠炎沙门氏菌和巨型球菌生长的拟合。相同的数据不同的模型拟合效果不同,所以需要对不同模型进行选择同样,对数字化的DGGE图谱进行模型的拟合,同样得出4℃和10℃这两个温度下该方法对单增李斯特氏菌的拟合相关系数R~2均在0.9以上,对于假单胞菌的拟合相关系数有0.8以上,而对于其他3株菌的拟合相关系数R~2低于0.7。副溶血弧菌在4℃条件是致死的一种情况,μmax是负值,而且只有Baranyi模型对单增李斯特氏菌和肠炎沙门氏菌拟合所得的延滞期是非负数,所以Baranyi模型适合用于以上两株菌的拟合。从模型拟合结果显示,DGGE方法能很好的呈现微生物的生长趋势。本文首次运用DGGE方法对图谱数字化并建立微生物预测模型;首次运用real-time PCR定量方法和DGGE方法所得数据同时建立了多株菌的预测模型。由于分子生物学快速、灵敏、特异性好等优点,real-time PCR方法已被用于微生物定量检测。对于一些实验室不能培养的微生物却能用分子生物学方法定量,而且传统的微生物计数方法通过一种选择性培养基只能检测一种微生物,而且在背景微生物复杂的情况下选择性培养基的特异性就会收到干扰,所以分子生物学方法不但同时可以检测多种微生物而且特异性好。运用分子生物学定量方法来建立微生物预测模型,在国内外都是一个很新的概念。考虑到样品DNA提取、PCR操作、模型选择等问题运用分子生态学建模还需要很多人进一步的优化条件,选择更合适的模型。而DGGE方法虽然不能很准确的反应微生物的数量,但是从条带的峰值可以间接的反应微生物的量。但是,运用于建立微生物预测模型还属首创,从本实验结果可以得出,用DGGE图谱数字化方法建立微生物预测模型可以得出微生物的生长趋势。但是,运用分子生态学方法建模还处于起步阶段,但是由于该方法的一些优越性,运用该方法建立预测模型将成为预测微生物学的一种新趋势。
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