论文部分内容阅读
背景:龋病是常见的口腔慢性疾病之一,若不及时处理,会导致牙齿疼痛、脱落甚至败血症的发生,从而影响儿童的咀嚼功能、营养摄入和睡眠质量等,还可能对儿童的心理健康造成不良影响,因此,儿童龋病的早期诊断和定期检测具有重要临床意义。唾液是龋病发生的局部微环境,其微生物群落与龋病的发生发展密切相关,因此本研究旨在探索混合牙列期儿童与龋病相关的唾液微生物群落,探讨唾液微生物群落对龋病诊断的意义。目的:分析中国不同地域混合牙列期儿童与龋病相关的唾液微生物群落,展示了其群落组成、生物多样性特点、群落结构差异等,探究了其与龋病之间的关系,并剖析宿主性别、疾病状态和地域因素对其群落结构的影响。评价唾液微生物群落作为龋病诊断工具的潜力,构建并优化了一个基于唾液微生物群落的在混合牙列期儿童中具有普遍适用性的龋病诊断模型,为以菌群为基础的疾病诊断和预测奠定理论基础。方法:收集130名(青岛96名,广州34名)6~8岁混合牙列期儿童的非刺激性唾液样本,其中包括65名高龋儿童(C组,DMFT+dmft≥6)和65名健康儿童(H组,DMFT+dmft=6)。对所有样本进行DNA提取,通过16S r RNA基因测序分析唾液微生物群落结构与组成,探究宿主性别、疾病状态和地域因素对唾液微生物群落结构的影响。在分析结果的基础上,探索唾液微生物群落与龋病之间的关系,寻找潜在致龋标志物,最后基于随机森林算法构建混合牙列期儿童普适性龋病诊断模型。结果:(1)疾病状态可显著影响唾液微生物群落的结构与组成:C组的α多样性显著低于H组(P<0.05),β多样性显著高于H组(P<0.05),且不同地域来源的唾液微生物群落均表现出相同的上述趋势;从门到种水平对细菌进行定量分析发现,菌群的构成在C组和H组间存在显著差异,但各分类水平均未发现疾病特异性细菌(即仅在一种状态中存在,但另一种状态中不存在的细菌)的存在。(2)地域因素是影响唾液微生物群落的首要因素(P<0.001),其次是疾病状态(P<0.05),而宿主性别则对混合牙列期儿童唾液微生物群落结构无显著影响(P>0.05),前二者共同解释了高达54%的唾液微生物群落结构差异。(3)我们基于健康样本的唾液微生物群落构建了区分样本来源的地域分类模型,模型准确率达78.88%。基于健康样本唾液微生物群落中筛选出的8个对地域分类效应最高的生物标记物所构建的地域分类模型,能够以92.31%的准确率对龋病样本的地域来源进行分类。(4)为明确不同分类水平对龋病诊断效能的影响,我们使用两个地域全部数据分别从门、属、种水平构建龋病诊断模型,利用ROC曲线对模型准确率进行评估,分别得到准确率AUC为门(AUC:64.11%,CI:54.54%-73.67%)、属(AUC:77.61%,CI:69.48%-85.74%)、种(AUC:88.56%,CI:83.56%-94.61%),表明在细菌种水平上构建的龋病诊断模型性能最佳。(5)在细菌种水平上构建的地域特异性龋病诊断模型,分别获得了84.38%(青岛组)和76.47%(广州组)的准确率;当交叉应用地域特异性龋病诊断模型时(即使用广州数据集所构建的龋病诊断模型应用于青岛数据集,或使用青岛数据集所构建的龋病诊断模型应用于广州数据集)模型准确率均保持在80%以上。(6)我们使用剔除地域因素后的数据构建诊断模型,发现模型诊断性能未受影响(AUC从88.56%升至88.99%)。因此,我们在排除上述8个地域标志物的基础上结合对区分疾病状态有贡献菌种的重要性排名结果,确定了14个生物标记物来构建在混合牙列期儿童中具有普适性的龋病诊断模型,该模型在不同地域应用时均表现出良好的诊断性能,准确率分别为:青岛市(AUC:91.02%,CI:85.27%-96.76%)、广州市(AUC:86.00%,CI:71.57%-100.00%)和跨地域(AUC:92.17%,CI:87.45%-96.88%)。(7)为进一步简化混合牙列期儿童普适性龋病诊断模型构建过程,我们尝试仅使用对疾病状态区分效应最佳的变形链球菌(Streptococcus mutans)作为唯一的生物标记物构建简化龋病诊断模型来判别全部样本疾病状态,仍可获得不错的准确率(AUC:81.62%,CI:74.40%-88.84%)。结论:本研究基于高通量测序手段,探究了混合牙列期儿童与龋病相关的唾液微生物群落。首先,我们分别比较和分析了不同地域(青岛和广州)不同疾病状态下(C组和H组)混合牙列期儿童的唾液微生物群落,发现不同分组间唾液微生物群落在结构和多样性存在显著差异。此外,我们通过定量分析唾液微生物群落组成,并未发现疾病特异性细菌的存在,说明龋病的发生不是一种或两种特异性致龋菌导致的,而是多种细菌共同作用的结果,实验结果支持“生态菌斑假说”。随后,我们剖析了不同因素对混合牙列期儿童唾液微生物群落的影响,结果显示地域因素对唾液微生物群落的影响强于疾病状态,而宿主性别则无显著影响。接下来,我们分别构建了样本的地域分类模型和龋病诊断模型,发现差异因素不会影响模型的判别性能,提示地域因素和疾病状态可能分别在不同维度影响着唾液微生物群落结构。最终,我们基于14个菌种构建了一个在混合牙列期儿童中普遍适用的龋病诊断模型,能够准确判别不同地域来源样本的疾病状态。在构建了混合牙列期儿童普适性龋病诊断模型后,为进一步简化构建过程,我们仅基于变形链球菌(Streptococcus mutans)构建了简化龋病诊断模型。我们发现,简化诊断模型仍能够较准确的判别样本疾病状态,这一发现再次证实了变形链球菌(Streptococcus mutans)在龋病发生发展中的重要作用。本研究的结果为建立基于微生物组的疾病诊断和预测工具提供了新思路,并为儿童龋病的定期监测和远程评估以及预后的改善奠定了基础。