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一、人源mRNA稳定蛋白HuR的结构与功能研究哺乳动物细胞中,mRNA的降解受到精确调控,这一调控机制需要顺式作用元件和反式作用因子的相互作用。其中研究得最详细的顺式作用元件是位于mRNA3’-非编码区的富含AU序列的元件(ARE)。这一序列元件最显著的一个特征就是具有数目和分布不等的AUUUA五联体核苷酸。目前已经鉴定出二十多种结合ARE的蛋白,包括本篇论文的研究对象HuR(human antigen R)。HuR蛋白属于脊椎动物Hu家族成员,该家族蛋白还包括HuB、HuC和HuD。HuR分子量约为36kDa,它的表达不具有组织特异性。这个蛋白含有三个RNA识别基序(RRM),其中N端两个串联的RRM结构域(RRM1/2)可以以高亲和力结合ARE,而位于C端的第三个RRM结构域则可以结合poly (A)尾巴和其他的蛋白配体。HuR被认作是一个关键的转录后调节蛋白而受到越来越多的关注。小角散射实验(SAXS)结果显示HuR的构象在结合底物RNA前后发生了很大的变化。但迄今为止还没有晶体结构从细节上验证这一结果。故研究HuRRRM1/2识别底物RNA的分子机制具有其实际意义。本论文中,我们解析了HuR RRM1/2无底物状态时的晶体结构。该结构呈现一种开放的构象,两个RRM结构域之间不存在任何相互作用。突变实验证实HuR RRM1/2与其他RRM结构域一样也是通过它的p片结合RNA的。我们同时也解析了HuR RRM1/2结合11个碱基RNA (5’-AUUUUUAUUUU-3’)复合物的晶体结构。该复合物的结构则是一种闭合的状态。RRM1/2通过一个碱性的沟槽结合底物RNA。荧光偏振实验结果显示RRM1是最主要的RNA结合结构域。通过结合自由能分析以及荧光偏振的实验结果分析,我们得出这样的推论,RRM1首先结合了底物RNA,随之HuR RRM1/2构象发生巨大变化,这样的变化使得RRM2和RRM1/2之间的linker提供更多的与RNA结合的接触面积,以此大大增强了HuR与RNA的亲和力。二、酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶3(GAPDH3)的结构与功能研究糖酵解途径是细胞产生ATP的重要方式。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH, EC:1.2.1.12)是糖酵解过程中一个关键的酶。在无机磷酸和辅因子NAD+存在时,GAPDH将底物甘油醛-3-磷酸(GAP)转化成1,3-二磷酸甘油酸。GAPDH的分子量约为37kDa,主要存在于细胞质中,也可以在不同细胞器之间穿梭。近些年来越来越多的实验证据显示GAPDH具有多种糖酵解过程外的功能。例如：DNA损伤修复、细胞凋亡、膜融合、tRNA转运以及mRNA稳定性调节等。已经有多个物种的GAPDH的晶体结构得到解析,但是关于GAPDH识别RNA的分子机制还不是很清楚。酿酒酵母中一共存在三个异构体形式的GAPDH: GAPDH1、GAPDH2和GAPDH3。之前的研究表明酵母中只有碱性最强的异构体(GAPDH1)具有结合poly(U)的能力。但是我们通过荧光偏振实验显示其中偏酸性的异构体GAPDH3也具有结合RNA的能力。为了研究GAPDH3结合RNA的分子机制,我们解析了GAPDH3的晶体结构。酿酒酵母的GAPDH3与其他物种的GAPDH具有十分相似的总体结构:NAD+结合结构域(氨基酸残基1-149)和催化结构域(氨基酸残基150-332).溶液状态下GAPDH3以同源四聚体的形式存在。酶活实验结果显示,GAPDH3对于NAD-的表观米氏常数约为682μM。荧光偏振实验结果表明GAPDH3可以结合mRNA (5’-AUUUAUUUAUUUA-3’),其解离常数Kd约为18μM。辅因子NAD+可以抑制其RNA结合能力且这种抑制作用呈浓度依赖型。关于GAPDH3结合RNA的分子机制的进一步研究正在进行中。