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气孔运动是植物体内水分代谢调控的重要过程,气孔运动的调节机理是植物生理学研究的重要内容。细胞外ATP(extracellular ATP,eATP)在植物生长发育和抗逆过程中发挥重要的调节作用,是植物细胞外重要的信使分子。本文研究了eATP对气孔运动的影响及其可能的信号转导机制。
本文采用拟南芥野生型材料、异三聚体G蛋白α亚基基因缺失突变体和超表达株系、ROS(reactive oxygen species)合成的关键酶-NADPH氧化酶的基因缺失突变体、以及三磷酸腺苷双磷酸酶催化亚基基因的缺失突变体为材料,采用表皮条生物分析、激光共聚焦显微技术、RT-PCR等实验方法对异三聚体G蛋白和ROS在eATP调节气孔运动的信号转导过程中发挥的作用进行了研究。结果表明:
拟南芥野生型经eATP处理后,气孔开度明显增大,且随着eATP浓度的升高,气孔开放所受促进程度加大;不可水解的ATP结构类似物(BzATP,ATPγS,2meATP)同样能够诱导气孔开放,ADP和GTP也能不同程度地促进气孔开放,而AMP和腺苷则无明显作用,表明细胞外ATP能够作为信使分子促进气孔开放。三磷酸腺苷双磷酸酶和葡萄糖-已糖激酶处理后,气孔开度明显减小,在自然光照下,三磷酸腺苷双磷酸酶催化亚基基因缺失突变体比野生型的气孔开度大,说明了内源eATP在气孔运动中同样起着正调控作用。
eATP处理后,异三聚体G蛋白α亚基基因超表达株系气孔开度变大,而异三聚体G蛋白α亚基基因缺失突变体的气孔开度变化不明显,表明异三聚体G蛋白可能参与了eATP促进气孔开放的信号转导过程。
叶片经外源ROS处理后,发现低浓度的ROS能促进气孔开放,而高浓度ROS促进气孔关闭;在eATP处理的同时加入细胞质膜NADPH氧化酶专一性抑制剂二亚苯基碘和还原剂二硫苏糖醇以抑制或清除细胞产生的活性氧基团,eATP不能促进气孔开放;NADPH氧化酶的基因缺失突变体经eATP处理后,气孔开度变化不明显。上述结果表明NADPH氧化酶参与的ROS形成在eATP诱导拟南芥气孔开放的过程中起着重要的作用,是eATP信号途径中必不可少的成员。
利用ROS荧光染料H2DCFDA,结合激光共聚焦技术检测结果显示,eATP处理后保卫细胞内ROS含量明显升高,在NADPH氧化酶基因缺失突变体中eATP不能诱导ROS水平升高;异三聚体G蛋白α亚基基因缺失突变体大大削弱了eATP诱导保卫细胞内ROS升高的过程,而超表达株系加速了eATP诱导保卫细胞内ROS升高的过程。表明异三聚体G蛋白介导了eATP诱导胞内ROS升高的过程。
上述结果显示,eATP能够作为信号分子促进拟南芥气孔开放,异三聚体G蛋白和ROS在此过程中发挥重要介导作用。