黄曲霉毒素(Afltoxin,AFT)是一类主要由寄生曲霉菌和黄曲霉菌产生的具有致癌、致畸和致突变的次级代谢产物,在黄曲霉毒素所有类型中,以黄曲霉毒素B1(AFB1)毒性最强,已经被世界卫生组织划定为I类致癌物。自然条件下,不同饲料原料中黄曲霉毒素的污染水平存在较大差异,探明不同原料黄曲霉毒素污染水平差异性的原因及可能的作用机制,对原料的选择、贮藏,预防及有效控制原料中黄曲霉毒素的污染,从而保证饲料产品质量安全具有重要理论依据和指导意义。因此,本项目在研究籽粒完整性对寄生曲霉菌产生AFB1影响的基础上,分析影响不同原料AFB1污染水平差异的可能成分,研究这些成分对寄生曲霉菌产生AFB1的影响,阐明不同饲料原料黄曲霉毒素污染水平差异性的原因及可能的作用机制。主要研究内容及结果如下:1.籽粒完整性对寄生曲霉菌产生黄曲霉毒素B1的影响研究试验选取饲料工业生产中的常规饲料原料(玉米、小麦、花生和大豆)及其副产品(玉米粕、小麦粕、花生粕和大豆粕)作为试验材料,接种寄生曲霉菌孢子液,在同等条件下培养15d,分别在0d,5d,10d和15d收集样品,通过高效液相色谱仪测定样品中AFB1的含量。结果表明:1)未灭菌、灭菌处理的粉碎玉米、花生、大豆和小麦及其副产品均随着培养时间的延长,刺激寄生曲霉菌产生AFB1的量增加。同时期未灭菌、灭菌粉碎样品,AFB1产生量均显著高于其对应饼粕类样品(P<0.05)。同时期灭菌粉碎的不同原料及其副产品AFB1含量均高于对应的未灭菌同类样品。2)玉米、小麦、花生和大豆籽粒样品随着培养时间的延长,除表面灭菌处理和高压灭菌处理的籽粒玉米在培养5d时AFB1含量最高外,其它籽粒样品(花生、大豆和小麦)产生AFB1的最高含量均出现在培养15d。寄生曲霉菌在玉米、小麦、花生和大豆籽粒上开始生长的部位不同。同等条件下,观察到寄生曲霉菌最先在籽粒玉米和小麦胚部开始生长,但在籽粒花生和玉米中的生长速度比在大豆和小麦中生长快速。说明籽粒结构及其完整性不同对寄生曲霉菌产生AFB1的影响也不同,这可能是影响寄生曲霉菌在玉米、小麦、花生和大豆中AFB1产生的重要因素。2.油脂种类及其水平对寄生曲霉菌在不同原料中产生黄曲霉毒素B1的影响研究试验以脱脂原料(脱脂玉米粉、脱脂大豆粉、脱脂小麦粉、脱脂花生粉、脱脂玉米胚粉和脱脂小麦胚粉)为试验材料,添加不同油脂(玉米油、花生油、大豆油和小麦油)的不同水平(2%,5%,10%和15%),接种寄生曲霉菌的孢子液,在同等条件下培养15d,分别在0d,5d,10d和15d收集样品,通过高效液相色谱仪测定样品中AFB1的含量。结果表明:1)不同油脂及其添加水平对寄生曲霉菌在对应脱脂原料中产生AFB1的影响。结果显示,所用的6种脱脂样品在培养前10d均随着培养时间和对应油脂添加水平的增加,AFB1含量线性增加,除脱脂玉米粉、脱脂大豆粉、脱脂小麦粉、脱脂小麦胚粉的15%油脂添加水平和脱脂小麦粉的2%、10%油脂添加水平AFB1积累程度在培养10d时最高,其余样品AFB1含量均在培养15d时最高。说明脂肪含量是影响寄生曲霉菌产生AFB1的重要因素,但不同油脂的同一个添加水平在对应的原料中产生AFB1的量和积累速度不同。2)不同油脂及其添加水平对寄生曲霉菌在不同脱脂原料中产生AFB1的影响。试验结果表明,不同油脂的同一添加水平对寄生曲霉菌在同一脱脂原料中产生AFB1的差异相对较小,而同一油脂同一添加水平对寄生曲霉菌在不同脱脂原料中产生AFB1的差异较大。在培养10d时,当四种油脂(大豆油、花生油、玉米油和小麦油)的15%油脂水平添加到脱脂大豆粉中,AFB1含量最大值是最小值的1.4倍。而当大豆油的15%油脂水平添加到不同脱脂样品(脱脂大豆粉、脱脂花生粉、脱脂玉米胚粉、脱脂小麦胚粉、脱脂玉米粉和脱脂小麦粉)中,AFB1含量最大值是最小值的31.3倍。其他油脂的不同油脂水平均出现类似趋势。而且在培养15d时,所有油脂种类及其油脂水平刺激寄生曲霉菌产生AFB1的量与培养10d时产生AFB1的量均出现类似趋势。说明脂肪含量是影响寄生曲霉菌产生AFB1的重要因素,但是脂肪种类对AFB1产生的影响较小。3.不同营养成分对寄生曲霉菌在合成培养基中产生黄曲霉毒素B1的影响及其可能的作用机制研究通过准确分析试验样品的不同营养成分(氨基酸、矿物质、碳和氮含量),选择可能影响黄曲霉毒素产生的成分和水平,以合成培养基为培养基质,接种寄生曲霉菌的孢子液,在同等条件下培养3d后收集样品。通过高效液相色谱仪测定培养液中的AFB1含量,Real-time PCR技术测定黄曲霉毒素生物合成过程中关键基因的表达量。结果表明:1)不同试验样品中各氨基酸(蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和赖氨酸)含量差异在几倍至几十倍。样品中矿物质(钾、钠、镁、钙、铁、铜、锌和锰)含量,除钙、钠含量差别较小外,其余矿物质含量差别较大,变化幅度在5-30倍。不同样品中碳含量差别较小,其最低碳含量和最高碳含量之间差别不足1.5倍。样品之间的氮含量差别较大,在10倍左右。2)天冬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸对寄生曲霉菌在合成培养基中刺激AFB1产生最明显,最佳添加水平分别是:1%,2%,4%和1%。甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸和赖氨酸随着添加量的增加对AFB1产生的影响较小。铁、铜、锰和锌对寄生曲霉菌在合成培养基中刺激AFB1产生的最佳添加水平分别是:30mg/L,24mg/L,30mg/L和10mg/L。镁和钾的添加水平在0.4%和0.1%时,最有利于AFB1产生。碳、氮含量及碳氮比分别在45%,4%,8:1时刺激AFB1产生效果最明显。说明适宜水平的营养成分含量能刺激寄生曲霉菌在合成培养基中产生AFB1。3)与对照组相比,天冬氨酸添加水平在1%时能显著上调afl R、afl O、afl D和afl U基因的表达(P<0.05)。苯丙氨酸和亮氨酸添加水平分别在2%和0.5%时能显著上调afl R、afl D、afl U、afl S和afl O基因的表达(P<0.05)。谷氨酸添加水平在1%能显著上调afl D、afl R、afl S和afl O基因的表达(P<0.05)。赖氨酸均有上调afl R、afl D、afl U、afl S和afl O基因表达的趋势但是与对照组相比差异不显著。铁的添加量在30mg/L时显著上调afl D、afl O和afl S基因的表达(P<0.05)。铜的添加量在24mg/L时显著上调afl R、afl D、afl S和afl O基因的表达(P<0.05)。锌的添加水平在10mg/kg时显著上调afl R、afl U基因的表达(P<0.05)。锰的添加水平在30mg/kg显著上调afl R、afl D、afl U和afl S基因的表达(P<0.05)。钾的添加量在0.1%时和镁的添加量在0.4%时分别显著显著上调afl R、afl S和afl U基因的表达(P<0.05)和afl R、afl D、afl U、afl S和afl O基因的表达(P<0.05)。碳含量45%时,afl R、afl D、afl U和afl S基因的表达显著升高(P<0.05)。氮含量4%时,与对照组相比能显著上调afl U、afl S和afl O基因的表达(P<0.05)。说明苯丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、铁、铜、锰和镁刺激寄生曲霉菌产生AFB1的最适添加水平,也能不同程度的上调黄曲霉毒素生物合成过程中afl R、afl S、afl O、afl U和afl D关键基因的相对表达。综合上述,本研究得出以下结论:1)籽粒结构及其完整性是造成寄生曲霉菌在玉米、大豆、小麦和花生中产生AFB1差异的重要因素。2)脂肪含量是影响寄生曲霉菌产生AFB1的重要因素,但是脂肪种类对AFB1的产生影响较小。3)苯丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、铁、铜、锰和镁可上调黄曲霉毒素生物合成过程中相关基因的表达,是刺激AFB1产生的重要因素。