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人类LMNA基因突变可引起严重的早发性衰老、肌肉营养不良、家族部分性脂肪营养不良和心肌病综合症等多种疾病,这些疾病统称为核纤层蛋白病。Lmna基因缺失小鼠具有核纤层蛋白病类似的临床特征,是研究核纤层蛋白功能及其相关疾病的一种常用动物模型。MicroRNA (miRNA)是一类强大的基因表达调节因子,可通过调节靶基因的表达参与细胞内多种生理、病理过程,包括衰老和心肌病等。尽管如此,miRNA在核纤层蛋白病中的表达、功能尚不完全清楚。本文拟利用Lmna基因缺失小鼠模型筛选差异表达的miRNA,并进一步探讨其在核纤层蛋白病中的作用及其潜在分子机制。第一部分miR-107在Lmna-/-小鼠MEFs及各组织中的表达目的验证前期通过Illumina Next Gen Sequencing方法筛选的在Lmna缺失和野生型C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中差异表达的miRNA并探讨其功能。方法应用real time PCR技术验证在测序结果中差异表达的miRNA(如mmu-miR-1、miR-107、miR-671-5p等);选取差异较大的miR-107,检测其在Lmna-/-和Lmna+/+ C57BL/6小鼠不同组织中的表达。结果miR-107在Lmna-/-小鼠MEFs中的表达水平显著低于Lmna+/+ MEFs,下调约52.1%(P<0.05);同时, Lmna-/-小鼠肝脏、心脏和肺组织中miR-107的表达均低于Lmna+/+小鼠(P<0.05)。结论与野生型C57BL/6小鼠相比,miR-107在Lmna-/-小鼠MEFs及心、肝、肺组织中呈显著低水平表达。第二部分miR-107及其靶基因CAVl参与调控Lmna-/- MEFs的衰老目的探讨miR-107与已知靶基因CAV1在Lmna缺失和野生型小鼠胚胎成纤维细胞衰老中的作用。方法分别在Lmna-/-和Lmna+/+ MEFs中过表达或沉默miR-107的表达,检测衰老相关p-半乳糖苷酶的活性及靶基因CAV1的表达变化。结果Lmna-/- MEFs中Cavl的mRNA和蛋白表达水平均显著增高,约为Lmna+/+ MEFs中Cav1 mRNA表达的1.7倍(P<0.05)。Lmna-/- MEFs (P4)中转染miR-107的模拟物mimics,可显著抑制CAV1的表达,p-半乳糖苷酶染色阳性细胞百分率减少约8%(P<0.05);而在Lmna+/+ MEFs (P4)中下调miR-107,可上调CAV1的表达,p-半乳糖苷酶染色阳性细胞百分率增加约为10%(P<0.05)。结论Lmna-/- MEFs中Cavl的表达水平显著高于Lmna+/+MEFs,miR-107可能通过调节CAVl的表达水平,参与调控MEFs的衰老。第三部分miR-107靶基因Cacna2d1的验证及结合位点研究目的 生物信息学预测并实验验证mmu-miR-107的靶基因Cacna2dl。方法利用TargetScan、miRanda、Clip-seq及miRDB预测其靶基因,分别构建含有候选靶基因(Cacna2dl、Capza2、Celsr2、 Csnklg2和jmem47) 3’UTR的荧光素酶报告载体pGL3,并用重叠延伸PCR技术分别构建含有Cacna2dl基因结合miR-107位点的3’UTR单个突变位点的载体Mut1200-207、Mut2361-367、Mut3902-908和同时含有3个突变结合位点的载体Mut4plus。将各重组质粒与miRNA mimics共转染C2C 12细胞,检测荧光素酶活性。实时定量PCR和免疫印迹法进一步验证miR-107对靶基因Cacna2dl的调控作用。结果 成功构建分别含有5个候选靶基因3’UTR的荧光素酶报告载体和Cacna2dl的4个突变质粒;与共转染候选基因3’UTR质粒和miR-NC组相比,共转染pGL3-Cacna2dl 3’UTR及]miR-107 mimics组C2C12细胞荧光素酶活性下降33.4%(P<0.01);且与共转染对应的突变体和miR-NC组相比,转染突变体Mut2361-367/Mut3902-908和miR-107]mimics组的荧光素酶活性均下降(P<0.05);转染突变体Mut1200-207/Mut4plus和miR-107 mimics组的荧光素酶活性下降不明显(P>0.05)。其余候选靶基因Capza2、Celsr2、Csnklg2和Tmem47的共转染组荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。过表达或下调C2C12细胞的miR-107,可有效降低或提高Cacna2dl的mRNA表达水平(P<0.05),且过表达miR-107可抑制Cacna2dl的蛋白表达(P<0.05)。结论 初步验证Cacna2dl是mmu-miR-107的靶基因,且结合位点为Cacna2dl 3’UTR的200-207。