恶性肿瘤，又称癌症，是一类严重危害人类生命的疾病，全球因癌症死亡的人数呈逐年增长趋势。多年来，肿瘤治疗一直是生命科学研究领域中关注的焦点，除外科手术、放射治疗之外；药物治疗是主要的治疗手段之一。很多具有显著细胞毒作用化学类药物、放射性药物被开发，由于缺乏特异性；随着血液循环分布到全身后不仅作用于肿瘤细胞的也作用于正常细胞，会引起很大的毒副作用；而日益发展起来的抗体、小分子抑制剂、基因药物等，虽然是针对肿瘤相关的特异性分子、基因发挥作用，有一定的靶向意义，但是进入体内后也分布于全身，只有少量药物能达到治疗部位发挥作用，同时可能导致正常组织器官的功能异常。由此可见，肿瘤药物治疗效果的限制，很大程度上在于药物缺乏分布特异性。为了解决这一瓶颈问题，达到高效低毒的疗效，靶向药物输送成为提高疗效的一个重要途径。 脂质体作为药物载体广泛应用于肿瘤药物输送中，采用不同种类膜材制备的脂质体有不同的药动学性质，具有不同的药物释放特点。膜材含有聚乙二醇(PEG)的脂质体，可以逃避网状内皮系统的捕获从而延长脂质体在血液中的循环时间，透过肿瘤血管向肿瘤部位浓集，起到被动靶向作用；针对肿瘤相关受体，将其特异性配体连接在脂质体表面，利用配体和受体特异性识别机制引导脂质体向靶部位选择性聚集并释放药物，起到主动靶向作用。将这两方面的靶向特征相结合的长循环配体脂质体，需要高特异性的配体和稳定的脂质体系统，以大大增强肿瘤药物的靶向性。 为了构建高效的靶向药物输送系统，将肿瘤相关的特异性表达或高表达受体被作为靶标，通过细胞表面受体特异性识别相应配体的机制，将配体连接的药物载体导向肿瘤组织。在受体介导的靶向系统中，作为“弹头”的配体，除单抗之外，多肽修饰脂质体等药物载体导向肿瘤相关特异性受体释药，具有广阔的前景。针对特异性受体筛选相应的多肽配体，可以采用噬菌体库展示、序列比对等方法，但是筛选到的一些多肽尽管能特异性结合受体或受体表达细胞，但却不一定能有效地用于构建靶向输送系统。 鉴于此，本课题中将小分子多肽用来修饰长循环脂质体，并通过体内外实验考察该脂质体对特定受体表达细胞或肿瘤组织的靶向性，一方面，得到能高特异性靶向受体细胞或肿瘤组织的多肽配体，建立高效的多肽导向脂质体靶向肿瘤输送系统。另一方面，可以优化和建立研究靶向脂质体输送系统靶向性的体内外模型，提供一个有效的多肽配体筛选平台。 本论文的主要内容及结果总结如下： 1.制备了性质稳定的长循环荧光脂质体，以配体插入法将表皮生长因子受体(EGFR)的天然配体EGF修饰脂质体构建了一个稳定的配体脂质体系统。根据激光共聚焦显微镜观察EGF-脂质体与高表达EGFR的细胞H1299的结合荧光，调整、优化这个脂质体系统的制备方法及其与细胞共孵育发生结合的条件，初步建立了配体脂质体特异结合受体的细胞模型。在我们的前期工作中，已经通过噬菌体展示技术、亲疏水性分析、序列/结构比对分析、计算机虚拟设计，针对大多数肿瘤细胞高表达的EGFR受体和Tie2受体初步筛选出一些有潜力的候选多肽配体。以EGF修饰的配体脂质体作为阳性参照，依据所建立的配体脂质体与细胞结合的方法，从中进一步选出能够介导脂质体显著结合高表达EGFR细胞的多肽D4、GE11。 2.为了更细致更深入地考察这两个多肽配体D4、GE11及其导向的脂质体系统是否能够高特异性靶向高表达EGFR的肿瘤细胞，着重将D4、GE11所修饰的荧光脂质体或载药脂质体作为研究对象，展开了一系列的体外实验。通过激光共聚焦显微镜技术，观察多肽D4、GE11荧光脂质体与不同细胞的结合荧光，并以游离EGF或多肽竞争结合H1299细胞考察多肽脂质体的结合特异性。结果表明，与对照脂质体相比，多肽脂质体除了与U87细胞发生强烈的非特异性结合，与其他表达EGFR的细胞均发生特异性结合，而且能促进细胞内吞作用。在竞争实验中，蛋白EGF、多肽D4或GE11明显能竞争结合细胞表面受体，引起对应多肽脂质体与H1299细胞结合减弱，受体的可饱和性充分说明了该脂质体与细胞受体结合的特异性。采用流式细胞技术测定一定数量的细胞样本上特异结合的脂质体荧光强度，进行更准确的量化分析统计。结果表明，以非靶向脂质体为对照，D4或GE11修饰的脂质体在H1299或SPCA1细胞上特异性结合并内吞引起细胞荧光强度增大。此外，用D4、GE11来修饰载阿霉素脂质体，对照非靶向脂质体阿霉素和游离阿霉素，用MTT比色试验来考察这两个配体所构建的脂质体阿霉素靶向高表达EGFR细胞的细胞毒性作用。根据药物浓度.细胞存活率曲线和软件拟合计算出的药物半数抑制浓度，对于H1299和SPCA1两种细胞，D4或GE11修饰的脂质体阿霉素的细胞毒性均大于对照脂质体阿霉素，更接近于游离阿霉素的细胞毒性。同时，MTT检测结果还表明，当多肽或蛋白浓度在1～10ug/ml时，D4、GE11的促细胞生长刺激作用很小。这些体外实验结果表明，多肽D4、GE11能导向脂质体特异性结合细胞并促进内吞，增强载药脂质体的细胞毒性。 3.与体外细胞模型相比，体内环境非常复杂，多肽识别受体并结合靶细胞受到多重生理、病理性因素的影响，单凭体外实验不足以证明所构建的配体脂质体的可行性。因此，为了进一步探索多肽及其修饰的脂质体在体内的靶向性，将多肽D4、GE11分别连接于荧光物质和荧光标记的脂质体上并注射到种有肿瘤的裸鼠体内，应用eXploreOptixMX(小动物活体光学分子成像系统)观测裸鼠体内的荧光分布情况，对多肽及其修饰的脂质体在体内的药动分布代谢进行了详尽的研究。通过与对照非靶向肽、游离荧光物质、非靶向荧光脂质体的比较，探讨了多肽D4、GE11及其修饰的荧光脂质体在接种高表达受体肿瘤细胞裸鼠体内的靶向性。荧光修饰的多肽D4、GE11，注射入H1299肿瘤裸鼠体内之后，较短时间内在肿瘤部位有聚集，但很快清除。D4修饰的脂质体注入裸鼠体内，注射后6小时开始逐渐越来越多地聚集在肿瘤部位，且明显聚集滞留时间达到80hr以上。GE11修饰的脂质体，从肿瘤局部扫描图中可以看出，从注射后1小时开始，在肿瘤部位有荧光脂质体的聚集。与实验组相比，对照组聚集在肿瘤部位脂质体的荧光强度较弱，且聚集荧光信号很快减弱。这表明，除了普通长循环脂质体在肿瘤部位的EPR效应引起被动靶向作用之外，D4和GE11修饰的脂质体能主动靶向高表达EGFR细胞引起内吞并产生延长脂质体靶向肿瘤时间的滞留作用。体内试验结果表明，多肽D4、GE11不仅特异性靶向肿瘤细胞，而且确实能高效地导向脂质体主动靶向肿瘤并产生较长时间的滞留聚集作用。 4.为了模拟肿瘤新生血管内皮细胞的生理特征，建立了人脐内皮细胞与肿瘤细胞共培养模型。以SPCA1细胞为阳性参照，通过细胞免疫荧光实验检测共培养内皮细胞的Tie2受体表达，为今后筛选靶向肿瘤新生血管内皮细胞的配体多肽提供合适的细胞模型。由复旦大学药学院陆伟跃教授实验室合成的RGD环肽是靶向肿瘤血管内皮细胞高表达的整合蛋白αvβ3的配体，用它修饰荧光脂质体，并采用所构建的共培养细胞模型来考察其对肿瘤血管内皮细胞的靶向性。荧光脂质体与细胞的结合试验表明，RGD环肽能导向脂质体与细胞发生特异性结合。在此基础上，还构建了D4、RGD共同修饰的荧光脂质体系统，希望能够为今后对靶向血管内皮细胞和肿瘤细胞的双功能脂质体的研发工作提供初步的依据。