研究目的:通过文献研究论述温阳补土活血法治疗恶性胶质瘤的机理,确立以温阳补土活血为治法,拟定加味桂枝乌苓汤,对Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤术后患者和C6胶质瘤细胞进行研究。观察加味桂枝乌苓汤改善恶性胶质瘤患者术后的临床疗效,通过临床数据客观评价温阳补土活血法改善恶性胶质瘤患者术后的卡氏评分、生存质量、中医症候、血液流变学及免疫指标等方面的意义与价值。并通过体外实验研究加味桂枝乌苓汤含药血清抑制C6胶质瘤细胞增殖的机制,从JAK2/STAT3信号通路探讨加味桂枝乌苓汤抑制C6胶质瘤细胞增殖,促进凋亡的分子机制。以探讨加味桂枝乌苓汤对恶性胶质瘤患者的治疗作用,为该方临床应用于恶性胶质瘤患者提供科学依据。研究方法:一、临床研究方法:依据纳入、排除标准筛选2015年1月起至2017年1月在我院住院的恶性胶质瘤患者50例,最终纳入47例,将患者随机分为治疗组和对照组,分别观察记录患者的卡氏评分、生存质量评分、中医症候评分、血液流变学指标、免疫学指标、血常规、肝肾功能等变化。二、实验研究方法:(一)血清提取:健康SD大鼠20只,体重200±20 g,雄性,随机分为空白组和含药血清组。大鼠等效给药量按人和动物体表面积折算,每日分2次灌胃中药汤剂,首次灌胃前禁食12h,连续灌胃3天,末次灌胃前禁食12h。最后一次给药1h后,从腹主动脉取血,处死老鼠。分离过滤血清,以DEME完全培养基将含药血清或空白血清稀释成不同浓度(即5%,10%,15%,20%,30%),分装保存。(二)细胞培养:复苏C6胶质瘤细胞系,用含10%胎牛血清的DMEM培养基将其于37℃、5%C02培养箱中培养,每隔1天进行传代,取对数生长期的细胞用于实验。(三)CCK-8法检测细胞生存率:取对数生长期的细胞,胰酶消化后混悬,细胞计数板计数后,接种于96孔板,每孔1OOul,含105个细胞。待细胞贴壁后,将细胞培养液更换为不同浓度的加味桂枝乌苓汤溶液和不同浓度的空白血清对照溶液,各实验组加味桂枝乌苓汤浓度为5%、10%、15%、20%、30%,每组6个复孔,置于37℃、5%C02培养箱中培养,分别于12h、24h、48h、72h培养,更换为DMEM培养基,同时每孔加入10ulCCK-8溶液,恒温培养箱内孵育1.5h,用全自动酶标仪在波长450nm处读取各孔光密度(OD)值。实验重复三次,算其平均值,计算细胞抑制率,绘制生长抑制曲线图,并作统计学分析。(四)Western Blot法检测:不同浓度的加味桂枝乌苓汤(5%、10%、20%)、非含药血清(5%、10%、20%)及胎牛血清,处理细细胞48小时,收集各组细胞核蛋白。按每泳道50ug蛋白质上样,经8%的SDS-PA分离电泳蛋白质,湿转致PVDF膜,5%BSA封闭,敷一抗4℃过夜,洗膜几次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1小时,用ECL发光液可视化蛋白质条带,并行X线胶片曝光,采用ImageJ软件对结果进行灰度分析研究结果:一、临床观察结果:(一)基线分析:两组性别基线、年龄基线、肿瘤级别基线和治疗前卡氏评分、生存质量评分、中医症候评分、血液流变学指标、免疫学指标等基线比较。统计结果表明基线分析无统计学意义(p>0.05)。(二)疗效评价:1、经独立样本t检验,治疗组治疗后卡氏评分、生存质量评分及中医症候评分与对照组比较(p<0.05),差异有统计学意义,说明治疗组的疗效优于对照组。经配对样本t检验,治疗组的卡氏评分、生存质量评分、中医症候评分治疗前后比较(p<0.01),差异有显著统计学意义,说明经加味桂枝乌苓汤治疗后患者的卡氏评分、生存质量评分及中医症候逐渐明显改善。2、卡氏评分的改善率治疗组和对照组分别为52.1%、20.8%;生存质量有效率分别为82.6%、62.5%,中医症候的缓解率分别为87%、58.3%。3、经重复测量方差分析,治疗组Th细胞比例在治疗前、治疗1周及治疗2周的改变与对照组比较(p<0.05),差异有统计学有意义。治疗组Ts细胞比例在治疗前、治疗1周及治疗2周的改变与对照组比较(p<0.01),差异有显著统计学意义,说明治疗组在改善Th细胞、Ts细胞比例方面优于对照组。经重复测量方差分析,治疗组Th细胞比例在治疗前、治疗1周及治疗2周的改变比较(p<0.01),差异有显著统计学意义;对照组(p<0.05),差异有统计学意义。治疗组Ts细胞比例在治疗前、治疗1周及治疗2周改变比较(p<0.01),差异有显著统计学意义;对照组(p>0.05),无统计学意义。说明在两周内治疗组在Th、Ts细胞比例方面,有逐渐改善的趋势;对照组2周内对Th细胞比例有改善,对Ts细胞比例无改善。4、经重复测量方差分析,治疗组的红细胞聚集指数、纤维蛋白原、血沉方程K值、血浆粘度改变在治疗前、治疗1周、治疗2周与对照组比较(p<0.01),差异有显著统计学意义;说明治疗组在治疗1周、治疗2周后的血液流变学指标明显改善优于对照组。经重复测量方差分析,治疗照组红细胞聚集指数、纤维蛋白原、血沉方程K值、血浆粘度在治疗前、治疗1周及治疗2周的改变比较(p<0.05),差异有统计学意义,说明经治疗2周后,血液流变学指标有逐渐改善的趋势。5、安全性比较:生化指标方面,试验过程中治疗组和对照组的血常规、及肝肾功能等指标在治疗1周、治疗2周后均未见明显异常,提示无明显各脏腑功能异常。不良反应方面,治疗组1例在治疗第6天出现厌食、腹胀,未经处理自愈,对照组中有3例出现头晕、心慌、皮疹等反应。二、实验研究结果(一)处理12h后5%、10%、15%、20%、30%浓度加味桂枝乌苓汤含药血清对C6胶质瘤细胞的抑制率分别为4.7%、9.6%、11.7%、13.5%、4.9%;作用24h的抑制率分别为 8.9%、12.1%、12.9%、14.8%,1.8%;作用 48h 的抑制率为 13.7%、16.1%、17.5%、19%、1.4%;作用 72h 的抑制率为 13.5%、15.5%、17%、18.5%、-1.7%。说明C6胶质瘤细胞经20%的加味桂枝乌苓汤含药血清处理48小时时,抑制率最好。(二)倒置显微镜观察细胞整体形态学改变:20%的空白血清组处理C6胶质细胞48小时后,显微镜下观察可见,细胞呈不规则梭形,突触多,折光度好,胞浆丰富,边缘清晰而且较饱满,培养皿黏合紧密。而浓度20%的含药血清组处理48小时后,多数细胞皱缩,细胞突起变短、消失,细胞大小不一,边缘毛刺。形态学改变提示加味桂枝乌苓汤有诱导C6胶质瘤细胞凋亡的作用。(三)加味桂枝乌苓汤处理48小时后,相同浓度含药血清处理后的JAK2/α-actin、P-STAT3/STAT3、Survivin/β-actin与对照组相比(p<0.01),差异有显著统计学意义;而含药血清处理组,经方差分析,5%、10%、20%浓度所得结果之间相互比较(p<0.01),差异有显著统计学意义。结论:临床观察:通过本课题的临床观察研究,温阳补土活血法在改善恶性胶质瘤患者术后卡氏评分、生存质量,中医症候、提高患者免疫功能、改善患者血液流变状态等方面有良好的效果,值得进一步深入研究。试验研究:加味桂枝乌苓汤通过JAK2/STAT3信号通路抑制C6胶质瘤细胞的增殖及诱导其凋亡,此发现为加味桂枝乌苓汤在治疗胶质瘤的临床药物研究方面提供了一定的基础实验依据。