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威宁豆酱以其独特的风味,在威宁地区备受青睐。威宁地区主要以家庭式作坊自然发酵生产为主,长期面临生产周期长、产品质量参差不齐、生产效率低等问题。因此,对威宁豆酱发酵菌种和工艺研究显得非常必要。以贵州省威宁地区传统方式制作的酱曲为样品,通过常规微生物学分离方法分离酱曲中的微生物,将分离纯化后的菌株分别制成菌悬液,接种于豆粉中进行纯种发酵。通过感官评价,筛选出与传统威宁豆酱风味相似的菌株。观察株菌形态进行初步鉴定,以通用引物扩增株菌的16S r DNA或r DNA内转录间隔区(r DNA-ITS)基因,连接至p MD18-T载体上,转化DH5α感受态细胞,选取阳性菌株提取质粒验证,然后测序;再结合VITEK 2全自动微生物鉴定系统进行鉴定;并对其生长特性进行研究。结合菌株生长特性对发酵工艺进行初步探索,并对成品豆酱理化指标进行分析,最后采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对纯种发酵豆酱和自然发酵豆酱的挥发性物质进行对比分析。研究结果如下:1.从威宁豆酱酱曲中分离纯化得到22株细菌,10株真菌,纯种回接发酵后感官评价结果表明,细菌DX-9和真菌DZ-3发酵的豆酱与传统威宁豆酱风味相似。通过分子生物学的方法和全自动微生物鉴定系统鉴定,确定DX-9为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),DZ-3为异常威克汉姆酵母菌(Wickerhamomyces anomalus)。生长特性研究表明,DX-9的最适生长温度为38℃,最适p H为7.0。DZ-3的最适生长温度为30℃,最适p H为5.5。2.通过正交实验,确定豆酱中辅料最适添加量为:食盐11%,辣椒粉6%,五香粉1%。通过单因素实验确定DX-9最佳的制曲时间为12 d、温度为38℃,后发酵时间为90 d、温度为40℃,接种量为2%;DZ-3最佳制曲时间为18 d、温度为34℃,后发酵时间为90 d、温度为36℃,接种量为3%。3.成品豆酱各项指标的测定结果为:自然发酵豆酱总酸为1.85 g/100g,氨基酸态氮为1.02g/100g,水分为55%,盐分为10.2%,p H为3.9;DX-9纯种发酵成品豆酱总酸为1.66 g/100g,氨基酸态氮为0.96 g/100g,水分为53%,盐分为10.4%,p H为4.8;DZ-3纯种发酵成品豆酱总酸为1.53 g/100g,氨基酸态氮为0.75 g/100g,水分为54%,盐分为10.5%,p H为5.6。对三种豆酱中大肠菌群和2种致病菌(沙门氏菌、金黄色葡萄球菌)检测显示,其含量均低于食品安全国家标准GB 2718—2014《酿造酱》中相应的要求。三种豆酱相比,色泽方面,自然发酵和DX-9发酵豆酱为褐色,DZ-3发酵豆酱为红褐色;气味方面,自然发酵酱香浓郁。纯种发酵豆酱酱香和酯香浓郁;在滋味上,三种成品豆酱豆味鲜醇厚、咸甜适口,而纯种发酵豆酱更加细腻;从体态上来看,三种发酵方式发酵豆酱均达到国标要求。4.GC-MS测定挥发性物质显示,自然发酵豆酱中共检测出73种,包括醇类10种、酮类7种、酯类12种、醛类6种、酸类3种、腈类3种、呋喃类2种、烃类21种、吡嗪类5种、吡咯类1种、含硫化合物1种、其他化合物2种。DZ-3发酵豆酱中检测出66种挥发性物质,主要包含醇类6种、酮类4种、酯类17种、酸类2种、醛类9种、呋喃类1种、烃类22种、吡嗪类1种、吡咯类1种,含硫化合物1种,其他化合物1种。DX-9中检测出52种,分别为醇类6种、酮类2种、酯类11种、酸类3种、醛类4种、呋喃类1种、烃类16种、酚类1种、吡嗪类3种、吡咯类1种、含硫化合物1种、其他化合物1种。通过挥发性物质主成分分析显示,威宁豆酱中的主效挥发性物质为烃类和酯类。综上所述,经过对威宁豆酱成曲中主要发酵的微生物分离、回接试验、鉴定,得到1株异常威克汉姆酵母菌(Wickerhamomyces anomalus)和1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵风味与自然发酵风味相似。结合2株菌的生长特性对生产工艺进行探索,确定了发酵过程中辅料的添加量;确定2株发酵菌的制曲时间和温度、后发酵时间和温度、接种量。通过GC-MS确定了威宁豆酱中主要挥发性物质。将2株主要发酵菌株应用在威宁豆酱纯种发酵工艺中,以提高产品质量和稳定性,稳定豆酱风味,降低生产成本,提高生产效率;也为威宁豆酱纯种发酵提供参考菌株。