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研究背景心血管重构(Cardiovascular remodeling)是心血管应对多种心血管病导致的心肌和血管损害或负荷增加所产生的一系列不适当结构改变,是心力衰竭、高血压等心血管疾病的重要病理基础。研究心血管重构的机制,对于防治心血管疾病的发生、发展具有重要意义。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-angiotensin-aldosterone System,RAAS)是一组存在于循环及组织里相互作用又相互影响的内分泌系统,在高血压及心血管重构等方面的调节中起着关键性作用。血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)是RAAS的关键转化酶,它能将血管紧张素Ⅰ(AngiotensinⅠ,AngⅠ)羧基端的二肽水解生成具有收缩血管作用的血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)。ACE在心血管重构的作用主要是通过增加AngⅡ的生成实现的。循环的AngⅡ可以收缩血管和促进醛固酮分泌进而升高血压;组织通过自分泌和旁分泌方式促进局部RAAS激活,组织的AngⅡ主要参与组织的重构。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是一个可特异性降解细胞外基质(Extracellar matrix,ECM)的锌离子(Zn2+)依赖性肽链内切酶家族。基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)是MMPs中的重要成员,广泛分布于心血管系统中,参与多种生理和病理过程,包括胚泡着床、炎症、溃疡、心血管重构等。在高血压、心肌病及心肌梗死等心血管疾病中都存在着MMP-9增高的现象,增高的MMP-9可以促进ECM中的胶原成分分解,导致心室壁抵抗力下降,心脏扩张及心功能障碍等。虽然既往研究已显示RAAS和MMPs各自对心血管重构有着重要作用,但两者的相互作用对心血管重构的影响尚未完全明了。目前RAAS激活可以促进MMP-9的表达并导致心血管重构的证据较多。例如,对小鼠输注AngⅡ可以上调MMP-9表达,并出现心肌肥厚;血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensin Converting Enzyme inhibitors,ACEI)类药物抑制MMP-9的表达而逆转心室重构等。但关于MMP-9能否作用于RAAS导致心血管重构的研究还比较有限。既往研究仅在体外实验发现,MMP-9可降解AngⅠ成为AngⅡ。我们课题组的前期实验中发现注射外源性重组MMP-9后可引起大鼠血压升高、心室重构,并且检测到体内ACE明显增多。这提示,MMP-9可能可以上调ACE表达激活RAAS,从而引起或加重心血管重构。如果MMP-9可以上调ACE表达,那它通过什么路径介导呢?在众多介导ACE表达的细胞内信号通路中,以p38 MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)信号通路与之联系最为紧密。p38 MAPK信号通道属于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中的一员。MAPK是细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是重要的细胞内信号传导系统之一,可以将细胞外刺激信号传导至细胞胞质及胞核内,参与细胞生理病理过程的调节。研究已证明,p38 MAPK可以介导上调ACE的表达,但未明确MMP-9是否也通过p38 MAPK信号通道上调ACE的表达。曾有实验发现,THP-1巨噬细胞在ox-LDL诱导下可增强p38 MAPK的表达,这种现象可以被MMP-9阻滞剂所抑制。因此我们推断,MMP-9调节ACE的表达可能也是通过p38 MAPK介导。综上所述,本研究的目的是探讨MMP-9能否调节ACE的表达及其调节的信号通路是什么?为进一步阐明MMP-9导致心血管重构的机制提供新的依据,为防治心血管疾病提供新的靶点。目的探讨MMP-9是否通过p38 MAPK信号通路调节内皮细胞ACE的表达。材料与方法取3~5代人脐静脉内皮细胞进行实验分组,分为2个大组:模型组和干预组,具体如下:1.MMP-9对人脐静脉内皮细胞上ACE蛋白表达的影响(模型组)3~5代人脐静脉内皮细胞随机分为4个小组:空白模型组、20ng/ml模型组、100ng/ml模型组及500ng/ml模型组。分别给予单纯细胞培养液、重组人MMP-920ng/ml、重组人MMP-9 100ng/ml、重组人MMP-9 500ng/ml共孵育24h后,采用CCK-8法检测细胞增殖情况,Western blot法检测细胞ACE和p38 MAPK蛋白表达。2.p38 MAPK阻断剂预处理对MMP-9所增加的人脐静脉内皮细胞上ACE蛋白表达的影响(干预组)3~5代人脐静脉内皮细胞随机分为4个小组:空白干预组、20ng/ml干预组、100ng/ml干预组及500ng/ml干预组。各组先给予SB203580(p38 MAPK阻断剂)10umol/L预处理2h,然后再分别给予单纯细胞培养液、重组人MMP-9 20ng/ml、重组人MMP-9 100ng/ml、重组人MMP-9 500ng/ml共孵育24h后,采用CCK-8法检测细胞增殖情况,Western blot法检测细胞ACE蛋白表达。结果1.人脐静脉内皮细胞形态的变化经过正常培养后,人脐静脉内皮细胞生长状态良好,在倒置相差显微镜下观察,细胞呈现圆形、卵圆形、梭形等形状,呈单层“铺路石”样,细胞胞浆丰富,轮廓清晰,边缘光滑。符合人脐静脉内皮细胞镜下特点,可以作为进一步探讨MMP-9对ACE作用的研究模型。在模型组和干预组组内,不同浓度MMP-9与人脐静脉内皮细胞共孵育24h后,在倒置相差显微镜下观察,细胞均贴壁生长,状态良好,未见细胞明显脱落。2.MMP-9对各组人脐静脉内皮细胞增殖均无影响在模型组和干预组组内,随着MMP-9浓度增加,四个小组间的细胞增殖并无明显差异(p>0.05)。另外,模型组和干预组两大组比较发现,在p38 MAPK阻断剂预处理后,干预组四个小组的细胞增殖和模型组中对应的各个小组也均无明显差异(p>0.05)。3.MMP-9能够增加人脐静脉内皮细胞p38 MAPK蛋白的表达水平在模型组组内,不同浓度MMP-9与人脐静脉内皮细胞共孵育24h后,随着MMP-9浓度增加,各组p38 MAPK蛋白逐渐增加,100ng/ml模型组及500ng/ml模型组的p38MAPK蛋白表达量均明显高于空白模型组(p<0.01)。而20ng/ml模型组与空白模型组并无明显差异(p>0.05)。同时,100ng/ml模型组的p38 MAPK蛋白表达量明显高于20ng/ml模型组(p<0.01),而500ng/ml模型组又明显高于100ng/ml模型组(p<0.01)。4.MMP-9能够增加人脐静脉内皮细胞ACE蛋白的表达水平在模型组组内,不同浓度MMP-9与人脐静脉内皮细胞共孵育24h后,随着MMP-9浓度增加,各组ACE蛋白表达明显增加,20ng/ml模型组、100ng/ml模型组及500ng/ml模型组的ACE表达量均明显高于空白模型组(p<0.01)。同时,100ng/ml模型组的ACE蛋白表达量明显高于20ng/ml模型组(p<0.01),而500ng/ml模型组又明显高于100ng/ml模型组(p<0.01)。5.p38 MAPK阻断剂明显减低MMP-9所增加的人脐静脉内皮细胞ACE蛋白的表达水平不同浓度MMP-9与SB203580(p38 MAPK阻断剂)预处理后的人脐静脉内皮细胞共孵育24h后,干预组中的空白干预组、20ng/ml干预组、100ng/ml干预组及500ng/ml干预组的ACE蛋白表达均较模型组中对应的各个小组明显下降(p<0.01)。另外,在干预组组内,随着MMP-9浓度增加,各组ACE蛋白逐渐增加,100ng/ml干预组、500ng/ml干预组两组ACE表达量均明显高于空白干预组(p<0.01)。而20ng/ml干预组与空白干预组并无明显差异(p>0.05)。同时,100ng/ml干预组的ACE蛋白表达量明显高于20ng/ml干预组(p<0.01),而500ng/ml干预组又明显高于100ng/ml干预组(p<0.01)。结论MMP-9可以通过激活p38 MAPK信号通路上调人脐静脉内皮细胞血管紧张素转化酶的表达。