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病毒性心肌炎（viral myocarditis,VMC）是由病毒感染所致的一种心肌炎症性疾病。大部分的VMC可以完全康复,但少部分进展为扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy,DCM）。目前VMC的发病机制尚未完全阐明。研究表明T细胞在VMC的发病环节中扮演重要角色,其中Th1细胞在VMC急性期即出现显著增高并分泌IFN-Y参与心肌炎症反应,Th17细胞通过分泌IL-17加重心肌损伤和促进纤维化。调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）是一类新发现的具有调节性功能的B细胞。其中最重要的亚型是分泌IL-10B细胞（IL-10-producing B cells）。分泌IL-10B细胞通过IL-10,在细胞水平调节其他细胞,尤其是效应性T细胞。已有的研究表明,调节性B细胞在一些免疫炎症性疾病中具有调节作用。然而,在VMC中,是否存在分泌IL-10B细胞,作用机制如何,目前尚未见报道。为此,本研究用柯萨奇病毒B3（Coxsackie virus B3,CVB3）建立小鼠VMC模型,深入探索分泌IL-10B细胞在小鼠VMC发病中的作用及其机制,为VMC的治疗寻求新靶点。本研究主要通过以下三部分进行。第一部分分泌IL-10B细胞在小鼠VMC发病过程中的变化目的:探讨分泌IL-10B细胞在VMC发病过程中的动态变化,及其与Th1、Th17细胞和心肌病理等指标的关系。方法:4周龄BALB/c小鼠80只,随机分为VMC组（n=50）和对照组（n=30）,两组BALB/c小鼠均设1、2、4周3个时点亚组。CVB3腹腔注射建立小鼠VMC模型,每个时点亚组小鼠分别为12只、18只、20只。腹腔注射PBS建立对照组,每个时点亚组小鼠均为10只。在相应时间点从两组各取10只小鼠,用流式细胞术检测脾脏分泌IL-10B细胞、CD1dhiCD5+B细胞、Th1细胞及Th17细胞,并且对心肌组织进行HE染色观察病理变化、计算心肌病理积分。结果:1、VMC组心肌组织HE染色显示,CVB3感染后1周出现心肌细胞局灶坏死和炎症细胞的浸润;第2周亚组心肌细胞坏死病灶增加、炎症细胞浸润明显增多;第4周亚组未见心肌细胞坏死、炎症细胞浸润不明显。对照组各亚组心肌组织病理均正常。2、VMC组心肌病理积分在1、2、4周亚组分别为2.30±0.48、2.90±0.74及1.40±0.52,与对照组各亚组（均为0）相比均显著增高（P均<0.01）,并且VMC组第2周亚组明显高于第1周亚组（P<0.05）及第4周亚组（P<0.01）。3、VMC组各亚组脾脏分泌IL-10B细胞与对照组各亚组比较,1、2、4周亚组比例均明显升高（2.70%±0.69%versus 0.90%±0.36%;3.10%±0.50%versus 1.18%±0.31%;1.37%±0.35%versus 0.97%±0.21%。P 均<0.01）,并且 VMC 组第 1、2 周亚组均明显高于第4周亚组（P均<0.01）。4、VMC组各亚组脾脏Th1细胞与对照组各亚组比较,1、2、4周亚组均显著增高（6.62%±L 00%versus 3.44%±1.34%;8.28%±2.04%versus 3.52%±1.15%;5.61%±1.14%versus 3.97%±1.01%。P均<0.01）,并且VMC组第2周亚组明显高于第1周亚组（P<0.05）及第4周亚组（P<0.01）。5、VMC组各亚组脾脏Th17细胞与对照组各亚组相比,在1、2、4周亚组均显著增高（2.46%±0.50%versus 0.98%±0.40%,P<0.05;5.35%±1.11%versus 1.12%±0.51%,P<0.01;2.49%±0.48%versus 0.98%±0.27%,P<0.01）,并且 VMC 组第 2 周亚组明显高于第1及第4周亚组（P均<0.01）。6、与对照组各亚组比较,VMC组1、2、4周亚组脾脏CD1dhiCD5+B细胞均明显增高（5.32%±1.20%versus 2.10%±0.66%;5.56%±1.03%versus 2.70%±0.63%;4.85%± 1.02%versus 2.85%±0.6%。P均<0.01）,VMC组各亚组间无明显差别（P均>0.05）。结论:CVB3腹腔注射成功建立小鼠VMC模型;VMC小鼠的脾脏分泌IL-10B细胞在发病的1、2、4周均明显增多,并且呈先高后低的变化趋势,而CD1dhiCD5+B细胞在发病过程中持续增多;VMC小鼠Th1细胞和Th17细胞在发病的1、2、4周均明显增多,并且第2周达高峰;伴随VMC模型的心肌炎发生、发展及恢复的病理改变,小鼠的分泌IL-10B细胞、Th1细胞和Th17细胞比例有相应平行动态改变趋势。第二部分 分泌IL-10B细胞对VMC小鼠Th1和Th17细胞的调节作用研究一、目的:探讨过继分泌IL-10B细胞对缺乏T和B细胞小鼠VMC的影响。方法:4周龄雄性BALB/c背景的SCID小鼠40只随机分成干预组（n=20）和对照组（n=20）。CVB3感染SCID小鼠建立VMC模型。干预组CVB3感染SCID小鼠前1天,尾静脉注射来源于急性VMC小鼠的分泌IL-10B细胞。对照组注射生理盐水作为阴性对照。观察两组小鼠的生存情况,并在第14天从每组中随机选取8只小鼠,对心肌组织进行HE染色观察病理变化、计算心肌病理积分。结果:1、干预组心肌病理积分与对照组比较无明显差别（3.28±0.28 versus 3.47±0.24,P>0.05）。2、两组的中位生存时间无差异（8.70d±0.57d versus 7.93d±0.65d,P>0.05）。结论:过继分泌 IL-10B细胞不能减轻缺T和B细胞的急性VMC小鼠的心肌组织的病理改变,也不能延长VMC小鼠的生存时间,提示分泌IL-10B细胞在小鼠VMC发病中通过T细胞而起作用。研究二、目的:探讨过继分泌IL-10B细胞对缺B细胞小鼠VMC的影响。方法:SCID 小鼠 60 只随机分成 3 组:na（?）ve 组（n=20）、sensitized 组（n=20）和contro1组（n=20）。尾静脉注射CD4+T细胞同时腹腔注射CVB3建立一个缺乏B细胞的小鼠VMC模型。在VMC模型建立前1天,分别尾静脉注射来源正常 BALB/c 小鼠（na（?）ve 组）、急性 VMC BALB/c 小鼠（sensitized 组）的分泌IL-10B细胞,contro1组注射生理盐水作为阴性对照。观察3组小鼠14天的生存情况,并在第14天从各组中随机选取10只小鼠,HE染色观察病理变化、计算心肌病理积分,RT-PCR检测Th1转录因子T-bet和Th17转录因子ROR γ t的mRNA表达量,流式细胞术检测脾脏Th1和Th17细胞的比例。结果:1、与对照组比较,naive组的心肌病理积分无变化（2.12±1.07 versus 2.87±0.85,P>0.05）,而 sensitized 组心肌病理积分显著减低（1.21±0.60 versus 2.87±0.85,P<0.01）。2、与对照组比较,na（?）ve组的中位生存时间无显著差异（12.50d±0.70d versus 11.05d±0.68d,P>0.05）,而sensitized组中位生存时间明显延长（13.4d±0.24d versus 11.05d±0.68d,P<0.05）。3、与对照组比较,na（?）ve组的VMC小鼠中脾脏Th1 和 Th17 细胞的比例无变化（4.10%± 1.74%versus5.83%±2.02%;2.24%±1.34%versus 2.92%± 1.32%。P 均>0.05）,而 sensitized 组 VMC 小鼠脾脏Th1和Th17细胞的比例均显著降低（3.20%±2.31%versus5.83%±2.02%,P<0.01;1.35%±1.24%versus2.92%±1.32%,P<0.05）。4、与对照组比较,naive组心肌T-bet mRNA和ROR γ t的mRNA表达量均无明显变化（3.76±1.49 versus4.62±2.60;155±0.90 versus2.67±1.92.P均>0.05）,而sensitized组心肌T-bet和ROR γ t的mRNA表达量均明显降低（1.31±1.28 versus 4.62±2.60,P<0.01;1.30±0.35 versus 2.67±1.92,P<0.05）。结论:免疫性过继来源于急性VMC小鼠的分泌IL-10B细胞可减轻缺B细胞小鼠的心肌炎病理改变、延长生存时间,其机制主要通过下调T-bet和ROR γ t的mRNA转录而降低Th1细胞和Th17细胞比例;过继来源于正常小鼠的分泌IL-10B细胞不能调节缺B细胞VMC小鼠的T-bet和ROR Y t的mRNA转录以及Th1细胞和Th17细胞的比例,因而缺B细胞VMC小鼠的心肌炎病理表现及生存时间也没有受到影响。提示分泌IL-10B细胞通过下调T-bet和ROR γ t的mRNA转录而降低Th1细胞和Th17细胞比例,从而抑制VMC小鼠心肌的炎症损伤。第三部分过继分泌IL-10B细胞对小鼠VMC发病过程的影响目的:探讨不同时点过继分泌IL-10B细胞对VMC小鼠心肌损伤及预后的影响。方法:4周龄BALB/c小鼠40只随机分成干预组（n=20）和对照组（n=20）。CVB3感染BALB/c小鼠建立VMC模型。干预组分别于CVB3感染前1天,VMC第3天或第7天尾静脉注射来源于急性VMC小鼠的分泌IL-10B细胞。对照组尾静脉注射生理盐水。观察两组小鼠14天的生存情况并在第14天从每组中随机选取10只小鼠,HE染色观察病理变化、计算心肌病理积分,流式细胞术检测脾脏Th1和Th17细胞的比例。结果:1、与对照组比较,VMC模型建立前过继分泌IL-10B细胞的干预组VMC小鼠的中位生存时间明显延长（13.80d±0.11d versus 11.80d±0.62d,P<0.05）,心肌病理积分明显低于对照组（2.08±0.54 versus 2.98±0.55,P<0.01）,脾脏Th1和Th17细胞的比例均显著降低（4.57%±2.04%versus8.71%±2.29%;3.58%±0.57%versus5.36%± 1.08%。P 均<0.01）。2、与对照组比较,VMC第3天过继分泌IL-10B细胞的干预组不能延长VMC小鼠中位生存时间（12.95d±0.37dversus 11.75d±0.64d,P>0.05）,但心肌病理积分明显减低（2.08±0.54 versus 2.94±0.30,P<0.01）,脾脏Th1 和 Th17 细胞的比例均显著降低（5.23%±1.94%versus8.17%±2.21%;3.35%±0.62%versus5.14%±1.20%,P 均<0.01）。3、与对照组比较,VMC第7天过继分泌IL-10B细胞的干预组VMC小鼠的中位生存时间无显著差异（12.55d±0.49d versus 12.20d±0.57d,P>0.05）,心肌病理积分无变化（2.47±0.66 versus3.01±0.56,P>0.05）,脾脏 Th1 和 Th17 细胞的比例亦无显著差异（4.60%± 1.97%versus 6.27%± 2.02%;4.03%± 0.60%versus4.87%±1.18%。P 均>0.05）。结论:在CVB3建立小鼠VMC前过继分泌IL-10B细胞可下调Th1和Th17细胞比例,从而减轻心肌炎症损伤、延长VMC小鼠的生存时间;VMC小鼠在发病的第3天过继分泌IL-10B细胞可下调Th1和Th17细胞比例从而减轻心肌炎症损伤,但不能延长生存时间;VMC小鼠在发病第7天过继分泌IL-10B细胞不能下调Th1和Th17细胞比例,也不能改变心肌炎症损伤及VMC小鼠生存时间。本研究结果提示:1、VMC小鼠的分泌IL-10B细胞在发病的1、2、4周均明显增多,并且呈先高后低的变化趋势;伴随VMC模型的心肌炎发生、发展及恢复的病理改变,小鼠的分泌IL-10B细胞、Th1细胞和Th17细胞比例有相应平行动态改变趋势。2、分泌IL-10B细胞在小鼠VMC发病中通过T细胞而起作用,并且主要通过下调T-bet和ROR γ t的mRNA转录而降低Th1细胞和Th17细胞比例,从而抑制VMC小鼠心肌的炎症损伤。3、在发病前或发病早期过继分泌IL-10B细胞,可下调Th1和Th17细胞比例,从而减轻VMC小鼠的心肌炎症损伤。