论文部分内容阅读
目的:乙型肝炎病毒是以逆转录方式进行复制的嗜肝DNA病毒。MOV10是宿主细胞重要的抗病毒因子,MOV10不仅抑制多种病毒复制,包括人类免疫缺陷病毒1型,丙型肝炎病毒、甲型流感病毒和水疱性口炎病毒,还限制了反转录转座子LINE-1,Alu,SVA的活性。然而MOV10是否可以抑制HBV复制及相关机制尚未报道。因此,本文重点研究宿主限制性因子MOV10对HBV复制的调控作用,初步阐明MOV10抑制HBV的机制。方法:(1)MOV10抑制HBV复制的表型研究:我们在慢乙肝患者的临床样本和HBV复制的细胞中检测了MOV10表达与HBV复制的关系:比较健康人和慢性乙肝感染患者外周血单个核细胞中MOV10的表达差异,在HBV稳定表达细胞HepAD38检测MOV10蛋白表达与病毒复制的关系,探讨MOV10和HBV复制的相关性;Huh7和HepG2-NTCP细胞通过siRNA干扰内源性MOV10,提取胞质中的病毒RNA和病毒核心颗粒的DNA,通过Southern blot,q-PCR、Northern blot检测病毒复制水平的变化,通过native gel检测病毒核心颗粒的变化;在Huh7和HepG2-NTCP中过表达MOV10,提取病毒颗粒DNA和RNA,通过Southern blot、Northern blot检测病毒复制水平的变化。(2)MOV10抑制HBV复制的机制研究:检测MOV10是否通过HBV启动子发挥抑制作用;IFN-α和IFN-γ刺激Huh7细胞,提取细胞RNA和蛋白检测MOV10的表达水平,探讨MOV10是否作为干扰素诱导基因发挥抗病毒作用;在Huh7中通过siRNA干扰干扰素上游基因IRF3和干扰素下游基因STAT1,共转染HBV和MOV10,荧光定量PCR分析病毒DNA水平的变化,探讨MOV10是否通过调控干扰素应答通路发挥抗病毒作用;构建MOV10解旋酶的保守结构域Ⅱ的酶活突变体(D645A、E646Q和G648A),检测酶活突变后对MOV10抗病毒作用的影响;探讨MOV10是否通过与病毒蛋白或病毒RNAs结合发挥抗病毒作用:HEK293细胞中共转染HBV复制质粒和MOV10表达质粒,免疫共沉淀试验检测MOV10是否和病毒核心蛋白HBc相互作用;在HEK293细胞中共转染HBV复制质粒和MOV10表达质粒,通过RNA-IP研究MOV10与HBV RNA的结合,探讨MOV10是否通过与病毒RNAs发挥抗病毒作用。结果:慢性乙肝感染患者外周血单个核细胞中MOV10表达水平低于健康人外周血MOV10水平;在HBV稳定复制的细胞系HepAD38中,去除四环素启动病毒复制后,MOV10蛋白水平下降,说明MOV10与HBV复制相关;Huh7中干扰内源性MOV10后,HBV DNA复制水平升高1.5倍,而病毒RNA和病毒Capsid无明显变化,在基于HepG2-NTCP的HBV感染模型中,干扰后病毒DNA水平增加1.5倍;Huh7细胞中过表达外源性的MOV10,显著抑制了HBV DNA的复制,而病毒RNA无明显变化,表明MOV10抑制病毒复制主要发生在DNA复制环节,同样在HepG2-NTCP的HBV感染模型中,过表达外源性的MOV10显著抑制病毒DNA的复制;在机制解析方面:MOV10不通过HBV启动子发挥作用;在肝癌细胞中,MOV10不受IFN-α和IFN-γ诱导发挥抗病毒作用;同样在肝癌细胞中,干扰干扰素通路上游基因IRF3和干扰素下游基因STAT1,MOV10的抗病毒作用没有显著消失,表明MOV10不通过干扰素通路发挥抗病毒作用;MOV10结构域Ⅱ突变体同样显著抑制HBV的复制,表明MOV10不依赖其解旋酶活性抑制HBV复制;通过RNA-IP实验,初步表明MOV10可以与HBV RNAs结合,进一步通过多重RT-PCR证明MOV10与3.5kb的pgRNA结合,这种结合可能是MOV10发挥抗病毒作用的关键。结论:在肝癌细胞中,宿主限制性因子MOV10的表达与HBV复制相关,其抑制HBV复制不通过作用于病毒的启动子,不依赖于其解旋酶活性,也不是作为干扰素诱导基因或促进干扰素通路发挥抗病毒作用来抑制病毒复制,其机制可能与HBV RNA结合有关。