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目的:
1.肾小球硬化是各种原因引起的肾小球损伤的晚期变化,是进展到慢性肾衰的共同病理基础。肾小球硬化以肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质(ECM)大量积聚为特征。其中转化生长因子β(TGF-β)在各种进行性肾脏疾病发展为纤维化中起重要作用,它是引起肾小球硬化的主要介质。而Smads蛋白是参与TGF-β超家族在细胞内信号传导的一族蛋白质,是TGF-β信号通路中的重要介质。本实验用体外人重组TGF-β1(5ng/ml)刺激大鼠肾小球系膜细胞,从细胞和分子水平系统观察TGF-β/Smad信号传导通路在肾小球硬化时细胞外基质形成中的作用。
2.肾素-血管紧张素-醛固酮系统(rennin angiotensin system,RAS)尤其是血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ),在血流动力学调节和在肾小球硬化中起重要作用。福辛普利(Fosinopril)是近年来发现的一种血管紧张素转化酶抑制剂,不但具有肯定且稳定的降压作用,而且对靶器官的保护作用也是独一无二的。在本实验中,我们选用福辛普利进行干预研究,观察其在TGF-β/Smad信号传导通路中对Smad2/3、p-Smad2/3和Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)表达的影响,以探讨福辛普利的肾脏保护用机制。
方法:
采用经典方法进行大鼠肾小球系膜细胞(GMC)的复苏、培养、传代。
实验分三组:(1)对照组(Ctrl),(2)TGF-β1(5ng/ml)刺激组(TGF-β组),(3)TGF-β1(5ng/ml)+Fos(1×10-4M)组(Fos组)。
①分别于TGF-β1刺激后6、12、24收集各组细胞用MTT比色法检测细胞增殖情况,计算细胞抑制率,细胞抑制率=(TGF-β组OD值-Fos组OD值)/TGF-β组OD值。
②分别于TGF-β1刺激后15min、30min、1、2、3、6、12、24h,收集各组细胞爬片用于间接免疫荧光检测P-Smad2/3表达情况。
③分别于TGF-β1刺激后15min、30min、1、2、3、6、12、24h后收集各组细胞上清液,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法测定ColI蛋白的变化,计算抑制率,抑制率=(TGF-β组OD值-Fos OD值)/TGF-β组OD值。
结果:
1、GMC增殖的变化在6、12、24h三个时间点中TGF-β组OD值均明显高于Ctrl组(p<0.01或p<0.05),Fos组OD值均低于TGF-β组(p<0.01或p<0.05),说明TGF-β可诱导GMC增殖,Fos组中随时间增加抑制率增加,说明ACEI对TGF-β诱导GMC增殖的抑制作用具有时间依赖效应。
2、间接免疫荧光结果P-Smad2/3在对照组只有极其微量的表达,TGF-β刺激组(5ng/ml)在刺激30min后荧光强度显著增强,且集中于胞核。激活至少可以持续2h以上。与TGF-β刺激组相比,Fos组(1×10-4M)P-Smad2/3表达下降,细胞荧光强度较弱。
3、细胞上清液检测结果在对照组Col I只有少量基础性分泌。与对照组相比,TGF-β刺激组(5ng/ml)在各时间点Col I分泌量显著上升(p<0.05),并且其刺激作用呈时间依赖性关系。与TGF-β刺激组(5ng/ml)相比,Fos组(1×10-4M)ColI蛋白表达量在15min到6h差异不明显(q=4.61,P>0.05),两组在12h(q=5.99,P<0.05)和24h(q=9.79,P<0.01)的差异有统计学意义。随时间增加抑制率增加,说明其抑制作用也呈时间依赖性关系。
结论:
1.人重组TGF-β1能够激活体外培养的大鼠肾小球系膜细胞P-Smads蛋白表达。
2.TGF-β/Smads信号途径在大鼠肾小球系膜细胞的激活能够引起I型胶原分泌的增多并能诱导GMC的增殖,其作用呈一定的时间依赖性关系。
3.福辛普利能够部分阻断TGF-β/Smads信号传导通路在大鼠肾小球系膜细胞的激活,抑制I型胶原的分泌及GMC的增殖,其抑制作用呈一定的时间依赖性关系。