药物诱导性肝损伤(Drug induced liver injury,DILI)简称药物性肝损伤,已经成为最重要的药源性疾病之一,严重威胁人类健康和医药事业的发展。来自美国的研究数据显示,DILI已经超过其他病因成为引起急性肝衰竭的首要病因。对乙酰氨基酚(acetaminophen,简称APAP)是引起固有型DILI的典型代表药物,也是欧美等国家引起急性肝衰竭并导致死亡的最常见药物。虽然对DILI的肝脏毒性已有较多研究,但是我们对DILI发生、进展的确切机制的认识还仅仅是冰山一角。尽管我们已经认识到,DILI患者最终的临床预后、转归是取决于损伤因素与适应性保护机制之间的相互作用,但是令人遗憾的是,迄今为止对于APAP诱导DILI(Acetaminophen induced liver injury,AILI)的机制研究几乎仅仅局限于前者,而对于同样决定患者临床转归的适应性保护机制则很少有专门的研究探讨。生长阻滞和DNA损伤诱导基因GADD45(growth arrest and DNA-damage gene45,GADD45)是一类广泛参与细胞周期调控、DNA修复、细胞存活、炎症和应激反应的基因。已有研究证明,肝细胞内高表达的GADD45a具有促细胞增殖、抑制p38以及JNK活化的作用。但是,迄今为止,GADD45a在AILI中的确切作用和机制尚不明确。本课题将通过构建APAP诱导的急性肝损伤体内外模型,利用RNA-seq、RT-PCR、western blot、LC-MS、siRNA转染、过表达腺病毒感染等细胞及分子生物学方法和HE染色、油红O染色、TUNEL染色及免疫组织化学染色等形态学方法,通过一系列的体内外实验探讨GADD45a在AILI中所发挥的作用及作用机制,为阐明药物性肝损伤的发生机制提供新的方向,为以GADD45a作为靶点来防治药物性肝损伤提供理论基础和实验依据。本课题主要包括以下三部分内容:第一部分:药物性肝损伤的转录组学研究及GADD45a的发现。通过构建APAP诱导的急性肝损伤体内外模型,进一步对发生APAP急性肝毒性的小鼠肝脏组织和AML-12细胞通过转录组学测序,研究APAP肝损伤时全基因组的转录本变化差异。在差异基因分析过程中,我们发现了GADD45家族在APAP肝毒性时发生明显变化,尤其以GADD45a的表达上调最为明显。第二部分:GADD45a在APAP诱导的急性肝损伤中的作用。1.通过人体肝脏组织标本和体内外实验研究APAP诱导急性肝损伤发生时,GADD45a的表达情况。首先,通过免疫组织化学染色检测药物性肝损伤病人的肝脏标本中GADD45a的表达,发现药物性肝损伤病人的肝细胞中GADD45a的表达增加。其次,建立药物性肝损伤体内外模型,检测GADD45a的表达情况。通过300mg/kg APAP腹腔注射C57BL/6J小鼠,建立APAP肝损伤的动物模型。利用AML-12细胞系,用20uM浓度的APAP刺激AML-12细胞,建立APAP肝损伤的体外模型。进一步通过RT-PCR、Western blot检测AML-12细胞和动物模型中GADD45a mRNA和蛋白的表达水平,我们同样发现GADD45a的表达发生明显上调。2.通过在APAP肝损伤体内外模型中过表达GADD45a,研究GADD45a在APAP肝损伤中的作用。我们利用腺病毒载体(Ad-GADD45a)分别过表达AML-12细胞及动物模型中的GADD45a,检测肝脏糖脂代谢相关基因的表达变化,检测APAP导致的DNA断裂情况以及肝细胞胞浆内小脂滴的聚集情况。实验结果显示:GADD45a过表达能够减轻APAP导致的DNA断裂,减少胞浆内小脂滴的聚集;GADD45a过表达能够促进脂肪酸β-氧化相关基因、三羧酸循环相关基因的表达,减少肝细胞内脂质蓄积,促进肝细胞对脂肪酸的利用。我们进一步通过RNA-seq分析了AILI中的WT小鼠和APAP肝损伤小鼠的肝脏转录组的变化情况,结果显示,在发生APAP肝损伤的小鼠肝脏组织中,脂质代谢相关基因的表达发生明显上调。通过液相色谱和质谱分析法(LC-MS),我们对已经过表达GADD45a的AML-12细胞用APAP刺激6h后的代谢物进行了分析,同样发现,GADD45a过表达后,AML-12细胞内三羧酸循环过程中明显加强。最后,通过分离培养原代小鼠肝细胞,利用siRNA干扰原代肝细胞以及AML-12细胞内的GADD45a的表达后,我们发现siRNA介导GADD45a低表达后,APAP能够使胞浆内的小脂滴明显增加,DNA断裂明显加重。以上研究结果提示我们,GADD45a在APAP诱导的急性肝损伤过程中发挥重要的保护作用。第三部分:GADD45a在APAP诱导的急性肝损伤过程中发挥保护作用的机制研究。1.研究AMPK信号通路在APAP诱导肝脏发生急性损伤时的活化程度和作用。首先通过对RNA-seq测序数据进行分析,我们发现AMPK通路在APAP诱导急性肝损伤时发生明显激活,AMPK通路上相关基因的转录表达水平也明显上调。其次,通过Western blot实验在APAP肝损伤体内外模型中检测APAP对AMPK通路的影响,实验结果表明AMPK通路在APAP急性肝损伤过程中发生明显的激活。进而,利用siRNA在原代小鼠肝细胞内干扰AMPKa的表达后,通过TUNEL染色和油红O染色,我们发现AMPKa表达降低后,APAP导致的DNA断裂明显加重,细胞内小脂滴的聚集明显增多。以上研究结果表明,AMPK通路在APAP诱导的急性肝损伤过程中发挥重要作用。2.研究GADD45a的表达对肝细胞内AMPK信号转导通路的影响。首先通过感染过表达GADD45a腺病毒到AML-12细胞中,进而用APAP刺激细胞来模拟APAP肝损伤。通过Western blot实验发现,过表达GADD45a可以显著增强AML-12细胞中AMPKa的磷酸化及其下游分子P-ACC、P-S6和P-S6K等的表达增加。其次,我们用siRNA干扰原代小鼠肝细胞内GADD45a的表达,通过Western blot发现,同对照组相比,降低GADD45a的表达后,AMPKa的磷酸化水平同样降低。以上研究结果表明,GADD45a在APAP诱导肝脏发生急性损伤的情况下,能够促进AMPK信号通路的激活。3.研究GADD45a促进AMPK激活的分子机制。通过以上实验,我们发现GADD45a在APAP诱导急性肝损伤时表达上调,AMPK信号通路发生激活。因此,我们将进一步探讨GADD45a与AMPK之间的关系。首先,我们通过免疫共沉淀(Co-IP)和蛋白质谱分析的方法,首次发现GADD45a能够与Ppp2cb蛋白直接结合,进一步的IP实验证实Ppp2cb能够和AMPKa结合。接下来,我们通过siRNA干扰AML-12细胞内Ppp2cb的表达,再感染过表达GADD45a腺病毒后,发现GADD45a促进AMPK磷酸化的作用消失。通过siRNA干扰原代小鼠细胞内Ppp2cb的表达,再感染过表达GADD45a腺病毒后,通过RT-PCR实验发现GADD45a促进AMPK通路的下游糖脂代谢相关基因表达上调的作用也消失。以上研究结果表明,GADD45a与Ppp2cb蛋白结合后,Ppp2cb对AMPK磷酸化的抑制作用消失,从而AMPK的活化增强,下游糖脂代谢相关基因表达增强。综上所述,本研究得出:在APAP诱导的急性肝损伤过程中,GADD45a表达明显增加,表达上调的GADD45a通过与Ppp2cb蛋白的结合,解除了Ppp2cb蛋白对AMPKa活化的抑制,从而促进了AMPK的磷酸化,促进下游糖脂代谢基因的表达,调节肝脏糖脂代谢平衡,促进细胞存活,减轻APAP导致的肝损伤。本课题将为药物性肝损伤的防治提供新的靶点和理论、实验依据。