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万古霉素耐药可变性肠球菌(VVE)是一类携带万古霉素耐药基因而表型敏感,在万古霉素压力下具有转变为耐药表型能力的肠球菌。由于VVE易于逃脱检测及筛查、散播耐药基因甚至带来临床治疗失败的风险,因此必须加强对VVE的监测及耐药机制的研究。近年来,国外陆续出现vanA+VVE爆发流行的报道和耐药机制相关研究。而vanM成为近年来中国临床肠球菌中流行的万古霉素耐药基因。本研究旨在调查vanM+VVE在杭州地区的流行现状,并深入研究其耐药转变的机制。第一章,为了明确vanM在临床分离肠球菌中的分布情况,本部分研究采用PCR对1284株临床分离肠球菌进行vanM筛查,并对筛得的vanM+菌株进行药敏检测、MLST分型和PFGE同源性分析;通过S1-PFGE、核酸杂交、全基因测序分析及荧光定量PCR,对vanM进行基因定位、周围环境序列分析及表达量分析。结果显示,vanM在临床肠球菌中的分离率为4.36%(56/1284)。这56株vanM+菌株(55株屎肠球菌和1株粪肠球菌),只有一株屎肠球菌SRR22对万古霉素和替考拉宁耐药(MIC≥256)。绝大部分(54/55)vanM+屎肠球菌属于最重要的院内流行克隆复合体CC17。vanM通常由质粒携带,只有一株屎肠球菌ZY11,vanM位于染色体上。55株vanM+VSE菌株携带的vanM转座子呈现出多样性—两个或三个IS1216E元件插入vanM耐药基因簇不同的位置,导致vanR、vanS、vanH或vanXX出现不同程度的缺失或打断。定量逆转录PCR分析进一步验证了vanM基因在VRE菌株中的组成型表达水平比VSE菌株中高5.36倍以上。本研究结果表明,临床肠球菌中以沉默形式存在的vanM耐药基因簇成为杭州地区重要的万古霉素耐药基因储存库。第二章,为探究vanM+VSE是否具有转变为耐药表型的能力,本部分研究对54株携带不完整vanM耐药基因簇的VSE菌株进行万古霉素浓度递增的体外诱导试验,对获得的诱导耐药株进行药敏测定及接合试验。结果表明,有将近半数(25/54)的vanM+VSE具有转变为耐药表型的能力,即严格意义上的VVE。此外,菌株携带的vanM耐药基因簇的完整性会影响表型转变的潜力。其中,携带仅vanRS缺失的vanM耐药基因簇(Ⅲ转座子类型)的VVE,极其容易形成耐药,在2天内即可获得对万古霉素和替考拉宁均高水平耐药的诱导株。而携带仅vanX缺失或vanX和vanRS均部分缺失的(Ⅱ和Ⅰ转座子类型)的VVE,需要较长的时间(3～14天)才能转变为万古霉素耐药表型,而且对替考拉宁多数为敏感或中介。此外,通过接合试验我们发现,Ⅲ转座子类型的VVE的诱导耐药株(除vanM位于染色体的ZY11的诱导耐药株之外)接合频率为1.01～5.37× 10-3,Ⅱ和Ⅰ转座子类型的VVE的诱导耐药株均接合失败。第三章,为阐明vanM+VVE耐药表型转变的机制,本部分研究中,挑选三株不同转座子类型VVE代表菌株进行后续研究:通过全基因组测序及分析、定量PCR、PFGE及杂交等技术,探寻VVE菌株在诱导前后DNA、mRNA或细胞水平发生的变化。结果发现,与亲本株相比,诱导耐药株的vanM耐药基因簇序列没有变化,但整个耐药簇的拷贝数出现了数十倍(45～94倍)的增加。诱导耐药株的Nanopore或Pacbio测序原始数据中找到了含有至少5个串联重复的vanM转座子的测序片段,证实了vanM耐药基因簇是以串联重复的形式进行扩增。vanM耐药基因簇两侧的IS1216E元件,是重复单元之间共同的接头。此外,与亲本株相比,诱导耐药株vanM表达量增加了数十倍,而生长速率明显下降。总之,本研究首次阐明vanM耐药基因簇以IS1216为接头的串联扩增,是vanM型VVE形成耐药的主要机制。此外,vanM耐药基因簇的扩增和累积,会造成基因重排、表达量增加和适应性代价。