目的:卵巢上皮性癌(简称卵巢癌)是卵巢恶性肿瘤中的主要类型,它有两个显著特点:一是早期诊断困难,75%的患者就诊时已到临床晚期,晚期患者的5年生存率仅20%,而早期则高达85%-90%[1];二是其具有独特的生长和转移规律,与其他实体瘤经由血液系统或淋巴系统转移至远处不同,卵巢癌长期局限于腹腔,癌细胞在腹膜间皮细胞黏附、种植并形成转移灶,最终由于腹腔病灶广泛累及网膜、胃肠道和肝脾等脏器而导致患者死亡。所以,早期诊断和对晚期病例控制腹腔广泛转移是卵巢癌诊疗过程中的两个关键环节。间皮素是近年来发现的与卵巢癌的诊断及病情监测密切相关的一项指标。本课题组前期研究已经发现间皮素基因是卵巢癌组织中表达上调最显著的基因。前期的研究还发现间皮素过表达与基因沉默对卵巢癌细胞株的黏附、迁移和侵袭力的影响有显著差异。间皮素是可以释放入血和体液(腹腔液)的分子,与CA125互为配体,是腹腔微环境中的重要成分之一,微环境中间皮素对卵巢癌细胞的生长、凋亡、转移及成瘤影响的机制尚未清楚。本研究目的:1、探讨间皮素(mesothelin, MSLN)蛋白对卵巢癌细胞SKOV3增殖能力及侵袭粘附能力的影响。2、探讨间皮素蛋白对卵巢癌细胞抗失巢凋亡(Anoikis)的影响。3、探讨间皮素蛋白对裸鼠腹腔移植瘤成瘤率、瘤重及组织细胞周期影响。方法:1间皮素蛋白最佳作用时间及浓度的确定:Raffit Hassan[24]等研究发现,21名卵巢癌患者中,95%的血清间皮素水平在9ng/ml到49ng/ml之间,5%大于50ng/ml。故本实验预实验选用含0ng/ml及50ng/ml间皮素蛋白的条件培养基培养卵巢癌SKOV3细胞,MTT测定其增殖变化,未发现明显改变。加大浓度,以分别含100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml间皮素蛋白的培养基培养卵巢癌SKOV3细胞,作用12、24、36、48小时,各时间点分别以MTT测定其增殖变化。最终确定间皮素蛋白作用于卵巢癌细胞SKOV3的最低有效浓度是200ng/ml,最佳作用时间为36小时。2以利用MTT方法测出的适当的间皮素蛋白浓度200ng/ml干预SKOV3细胞,做平板克隆形成实验进一步测定间皮素对卵巢癌细胞增殖情况的影响。3用人工基底膜材料Matrigel作为粘附介质进行粘附功能检测。MTT测定卵巢癌细胞SKOV3的粘附率,观察经200ng/ml的间皮素蛋白干预后,其黏附能力变化。4利用Transwell小室体外细胞转移侵袭装置测定经200ng/ml间皮素蛋白干预后SKOV3细胞的迁移、侵袭能力的改变情况。5采用软琼脂克隆形成实验,检测200ng/ml的间皮素蛋白对卵巢癌细胞SKOV3非锚定依赖生长能力的影响;抑制接触培养法建立细胞失巢凋亡(Anoikis)诱导模型,流式细胞仪检测经200ng/ml间皮素蛋白作用后卵巢癌细胞SKOV3在失巢凋亡模型诱导下细胞凋亡率的改变;Western Blot检测经200ng/ml的间皮素蛋白干预后的SKOV3细胞在失巢凋亡模型诱导下,细胞中凋亡前体蛋白Bim的改变情况。(Bim,一种凋亡前体蛋白,由单独BH3区域组成,已经被证明在诱导失巢凋亡中发挥着重要的作用[19-22])。6建立裸鼠动物实验模型,注射收集好的细胞(分别为对照组及实验组细胞,实验组为以含200ng/ml间皮素蛋白的培养基培养的卵巢癌细胞SKOV3,作用36小时;对照组为不含间皮素蛋白的培养基培养36小时),将两组细胞分别注入裸鼠腹腔,使其成瘤,2周后处死裸鼠,观察成瘤率、瘤重、最大肿瘤直径、转移部位及转移瘤个数的变化。取出各组瘤体,以70%酒精固定,采用流式细胞术检测各组瘤组织细胞周期的变化。6.1裸鼠动物模型的建立及实验分组雌性BALB/c裸小鼠,4-6周龄,体重13.5-16.5g,在清洁级(SPF级)环境中培养,将裸小鼠随机分成2组,A组为对照组,注射未经间皮素蛋白干预的卵巢癌细胞SKOV3组;B组为实验组,注射经200ng/ml间皮素蛋白干预的卵巢癌细胞SKOV3组,每组5只。收集两组卵巢癌细胞悬液,分别以2×107/ml的细胞浓度注射到裸鼠腹腔内,每只注射0.2ml。6.2相关指标检测观察2周内裸鼠的生活习性等改变。2周后处死裸鼠,观察成瘤情况,称量瘤重,测量最大肿瘤直径,计数转移部位及转移瘤个数,比较两组之间的差别。取出瘤组织,以70%酒精固定,采用流式细胞仪检测两组瘤组织细胞周期的变化。7统计学方法:数据统计结果以均数±标准差表示,采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理,进行正态性检验,采用成组T检验法分析。按α=0.05水平,P<0.05表示差异有显著性,P>0.05表示差异无显著性。结果:1间皮素可增强卵巢癌细胞的生长增殖能力,间皮素蛋白作用于卵巢癌细胞SKOV3的最低有效浓度为200ng/ml,最佳作用时间为36h。2经200ng/ml间皮素作用后的卵巢癌细胞SKOV3,克隆形成率显著增高。3粘附率比较:SKOV3细胞对照组(未经间皮素蛋白干预)为(37.83±3.67)%,实验组经200ng/ml间皮素作用的细胞粘附率为(70.75±4.22)% ,该细胞的实验组和对照组粘附率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。4迁移数目比较:SKOV3细胞对照组迁移到滤膜下面的细胞数为( 50.33±4.72)个,实验组经200ng/ml间皮素作用的细胞迁移到滤膜下面的细胞数为( 71.25±6.45)个,实验组和对照组迁移细胞数目相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。5侵袭数目比较:SKOV3细胞对照组侵袭到滤膜下面的细胞数为( 19.67±2.57)个,实验组经200ng/ml间皮素作用的细胞侵袭到滤膜下面的细胞数为( 32.08±3.02)个,实验组和对照组迁移细胞数目相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。6软琼脂克隆形成实验:在培养液中加入200ng/ml的间皮素蛋白,可以显著提高SKOV3细胞的克隆形成能力(p<0.01);抑制接触培养模拟失巢凋亡试验:实验组SKOV3细胞(在加间皮素蛋白200ng/ml的培养基中培养)的凋亡率比对照组细胞的凋亡率低,差异有统计学意(P<0.05)。正常悬浮培养48 h后对照组SKOV3细胞的凋亡率是(23.89±3.48)% ,加入200ng/ml间皮素蛋白的凋亡率降至(12.11±2.7)%,两组的凋亡率比较,差异有统计学意义(P=0.004<0.05)。7裸鼠移植瘤模型实验B组(接种实验组SKOV3细胞,即在含200ng/ml间皮素蛋白的培养基中培养36小时)的裸鼠在接种第5天后开始出现活动减少、动作迟缓、体重及腹围增加明显,而A组(接种对照组SKOV3细胞,即在未含间皮素蛋白的培养基中培养36小时)裸鼠于第8天后相继出现类似症状。第12天有B组的1只裸鼠自然死亡,其余9只裸鼠成活至14天处死。A组及B组之间移植瘤重量、移植瘤转移部位数、肿瘤转移个数相比,均有统计学差异(p<0.05)。两组最大移植瘤直径相比无统计学差异(p>0.05)。流式结果显示:间皮素蛋白处理组对比对照组,处于S期的细胞数量明显增多,处于G1期的细胞数减少,细胞生长活跃。结论:1、间皮素蛋白可以增强卵巢癌细胞SKOV3的生长增殖能力及粘附、迁移和侵袭能力。2、间皮素蛋白可以使卵巢癌细胞SKOV3失巢凋亡率较低,增强其失巢凋亡能力,作用机制可能与凋亡前体蛋白Bim的降低有关。3、200ng/ml的间皮素蛋白可以促进裸鼠腹腔移植瘤的生长、转移,可以使移植瘤组织中处于S期的细胞增多,处于G1期的细胞数减少,加速细胞周期进展。