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犬流感病毒（Canine Influenza Virus,CIV）是能够引起犬只体温升高、喷嚏、流涕等临床症状的甲型流感病毒，常常继发其他病毒性疾病和细菌性疾病，严重时可造成呼吸衰竭而死亡。在我国，CIV主要是来源于禽的H3N2亚型流感病毒，经过长时间的适应进化已经能够在犬群中稳定传播。犬的数量庞大，在全球至少有七亿只，并且大部分是作为人类的宠物伴侣，与人类的关系非常密切。由于犬的呼吸道具有SAα-2， 3 和 SAα-2，6 两种受体，因此可以同时感染禽流感病毒和人流感病毒，可能成为导致流感病毒基因重排的潜在的“混合器”。因此，开展犬流感的相关研究对公共卫生和人类健康的意义重大。
天然免疫限制因子Tetherin，又称为BST-2，CD317或者HM1.24，是Ⅰ型干扰素（Interferon, IFN）诱导产生的跨膜蛋白。Tetherin具有广谱性的抗病毒活性，利用自身特殊的拓扑结构在病毒出芽过程中将病毒粒子连接在细胞膜表面，限制病毒的有效释放。本文首次研究了犬Tetherin限制CIV复制的能力和作用机制，结果如下：1. 利用RT-PCR扩增比格犬Tetherin基因，将其克隆到p3×FLAG-CMV-10真核表达载体中，通过应用 ProtParam、Protscale、SOPMA、TMHMM、TargetP、SignalP、MotifScan和Interproscan等在线生物软件分析犬Tetherin基因和蛋白的生物信息学特性。结果表明：克隆获得犬Tetherin基因，序列CDS长度为567 bp，编码188个氨基酸，蛋白分子质量为20626.84 Da。犬Tetherin分别与人、黑猩猩、家猫、雪貂、豚鼠、马、家鼠、猪、猕猴及老虎的Tetherin的氨基酸序列相似性为42%、42%、60.4%、54%、30.5%、41.9%、37.3%、42.6%、42.2% 和 58.3%。犬 Tetherin 是不稳定性亲水蛋白，无信号肽，有一个跨膜结构域，属于Ⅰ型跨膜蛋白，具有糖基化和磷酸化位点。2. 对犬Tetherin在组织表达谱的分析发现，相对于其他组织和器官，免疫器官中Tetherin的含量特别丰富，且犬Tetherin基因序列上包含IFN应答元件序列，能够受到犬IFN-α的诱导调控和表达。3. CIV感染宿主时，也能导致Tetherin的mRNA表达水平显著提高。CCK-8检测证明Tetherin具有能够有效帮助细胞抵抗CIV感染引发破坏的能力。在Tetherin是否影响CIV增殖能力的实验过程中，结果发现，过表达Tetherin能够抑制CIV的复制，干扰Tetherin基因则会提升CIV在细胞的增殖能力。为了探究Tetherin抑制CIV复制的作用机制，本研究利用BiFC技术和Co-IP鉴定CIV中与Tetherin相互作用的蛋白，结果发现CIV的M1和M2都能与Tetherin相互作用，且Tetherin可以剂量依赖性的降解M2蛋白的表达。由于M1和M2蛋白在CIV复制、组装和出芽过程中都非常重要，因此本研究认为Tetherin除了可通过自身独特的拓扑结构在细胞表面住病毒粒子阻止其释放，还可能通过降解病毒编码的蛋白导致其功能缺失从而抑制病毒的复制。
miRNA 是宿主基因表达的主要调控因子，它是疾病诊断和治疗的有力工具。为了探究 miRNA 在病毒的致病性和宿主免疫应答中的作用，通过系统比较感染 CIV H3N2和CIV H5N1的犬肺中不同表达水平的miRNA，利用生物信息学软件对miRNA靶基因进行了注释和功能分析。本研究发现H5N1组与H3N2组相比，有229个miRNA上调，166个miRNA下调。H5N1组差异表达的miRNA的靶基因显著富集在两个代谢途径的通路上：甘油脂类代谢（Glycerolipid metabolism）和甘油磷酸酯代谢（Glycerophospholipid metabolism）。代谢途径的抑制可能会导致动物食欲减退、体重减轻和免疫力下降，从而使病毒更容易侵入机体，造成损害。此外, 本研究发现miR-485、miR-144、miR-133b、miR-4859-5p、miR-6902-3p、miR-7638、miR-1307-3p和 miR-1346 表达水平发生明显变化, 这些miRNA的靶基因都与天然免疫通路相关，如自然杀伤细胞介导的细胞毒性（Natural killer cell-mediated cytotoxicity），Notch信号通路、T细胞受体信号通路及JAK-STAT信号通路。这些miRNA表达水平的变化可能导致天然免疫相关通路的抑制, 从而提高 H5N1 对宿主的致病性。另外，本研究发现犬在受到CIV感染时靶向 Tetherin 基因的 miR-182 显著下调，说明机体能够通过miRNA调控Tetherin的表达水平，促进抗病毒应答能力，抑制病毒的复制。
综上所述，本研究通过对犬Tetherin蛋白的首次研究，证实了CIV感染过程中天然免疫限制因子Tetherin扮演重要角色，提示Tetherin在抗病毒分子靶标药物中的应用前景。通过系统分析被CIV H3N2、CIV H5N1感染的犬肺脏中miRNA差异表达，揭示了miRNA在CIV致病与调节天然免疫反应中的重要作用，加深对miRNA在流感病毒介导免疫防御与免疫损伤之间复杂关系的理解和认识。
天然免疫限制因子Tetherin，又称为BST-2，CD317或者HM1.24，是Ⅰ型干扰素（Interferon, IFN）诱导产生的跨膜蛋白。Tetherin具有广谱性的抗病毒活性，利用自身特殊的拓扑结构在病毒出芽过程中将病毒粒子连接在细胞膜表面，限制病毒的有效释放。本文首次研究了犬Tetherin限制CIV复制的能力和作用机制，结果如下：1. 利用RT-PCR扩增比格犬Tetherin基因，将其克隆到p3×FLAG-CMV-10真核表达载体中，通过应用 ProtParam、Protscale、SOPMA、TMHMM、TargetP、SignalP、MotifScan和Interproscan等在线生物软件分析犬Tetherin基因和蛋白的生物信息学特性。结果表明：克隆获得犬Tetherin基因，序列CDS长度为567 bp，编码188个氨基酸，蛋白分子质量为20626.84 Da。犬Tetherin分别与人、黑猩猩、家猫、雪貂、豚鼠、马、家鼠、猪、猕猴及老虎的Tetherin的氨基酸序列相似性为42%、42%、60.4%、54%、30.5%、41.9%、37.3%、42.6%、42.2% 和 58.3%。犬 Tetherin 是不稳定性亲水蛋白，无信号肽，有一个跨膜结构域，属于Ⅰ型跨膜蛋白，具有糖基化和磷酸化位点。2. 对犬Tetherin在组织表达谱的分析发现，相对于其他组织和器官，免疫器官中Tetherin的含量特别丰富，且犬Tetherin基因序列上包含IFN应答元件序列，能够受到犬IFN-α的诱导调控和表达。3. CIV感染宿主时，也能导致Tetherin的mRNA表达水平显著提高。CCK-8检测证明Tetherin具有能够有效帮助细胞抵抗CIV感染引发破坏的能力。在Tetherin是否影响CIV增殖能力的实验过程中，结果发现，过表达Tetherin能够抑制CIV的复制，干扰Tetherin基因则会提升CIV在细胞的增殖能力。为了探究Tetherin抑制CIV复制的作用机制，本研究利用BiFC技术和Co-IP鉴定CIV中与Tetherin相互作用的蛋白，结果发现CIV的M1和M2都能与Tetherin相互作用，且Tetherin可以剂量依赖性的降解M2蛋白的表达。由于M1和M2蛋白在CIV复制、组装和出芽过程中都非常重要，因此本研究认为Tetherin除了可通过自身独特的拓扑结构在细胞表面住病毒粒子阻止其释放，还可能通过降解病毒编码的蛋白导致其功能缺失从而抑制病毒的复制。
miRNA 是宿主基因表达的主要调控因子，它是疾病诊断和治疗的有力工具。为了探究 miRNA 在病毒的致病性和宿主免疫应答中的作用，通过系统比较感染 CIV H3N2和CIV H5N1的犬肺中不同表达水平的miRNA，利用生物信息学软件对miRNA靶基因进行了注释和功能分析。本研究发现H5N1组与H3N2组相比，有229个miRNA上调，166个miRNA下调。H5N1组差异表达的miRNA的靶基因显著富集在两个代谢途径的通路上：甘油脂类代谢（Glycerolipid metabolism）和甘油磷酸酯代谢（Glycerophospholipid metabolism）。代谢途径的抑制可能会导致动物食欲减退、体重减轻和免疫力下降，从而使病毒更容易侵入机体，造成损害。此外, 本研究发现miR-485、miR-144、miR-133b、miR-4859-5p、miR-6902-3p、miR-7638、miR-1307-3p和 miR-1346 表达水平发生明显变化, 这些miRNA的靶基因都与天然免疫通路相关，如自然杀伤细胞介导的细胞毒性（Natural killer cell-mediated cytotoxicity），Notch信号通路、T细胞受体信号通路及JAK-STAT信号通路。这些miRNA表达水平的变化可能导致天然免疫相关通路的抑制, 从而提高 H5N1 对宿主的致病性。另外，本研究发现犬在受到CIV感染时靶向 Tetherin 基因的 miR-182 显著下调，说明机体能够通过miRNA调控Tetherin的表达水平，促进抗病毒应答能力，抑制病毒的复制。
综上所述，本研究通过对犬Tetherin蛋白的首次研究，证实了CIV感染过程中天然免疫限制因子Tetherin扮演重要角色，提示Tetherin在抗病毒分子靶标药物中的应用前景。通过系统分析被CIV H3N2、CIV H5N1感染的犬肺脏中miRNA差异表达，揭示了miRNA在CIV致病与调节天然免疫反应中的重要作用，加深对miRNA在流感病毒介导免疫防御与免疫损伤之间复杂关系的理解和认识。