研究背景及目的肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC,下称肝癌)是临床上最常见的恶性肿瘤之一。全球发病率逐年增长,现已超过75万/年,位居恶性肿瘤发病率的第5位;死亡接近70万/年,位列肿瘤相关死亡的第2位。目前,我国肝癌发病人数约占全球的50%,在国内肿瘤相关死亡中位居第2位。肝癌具有发病隐匿、进展迅速、预后不佳等特点,目前手术切除及肝移植仍是肝癌患者最有效的治疗方式,尽管其他治疗模式,如无水酒精瘤内注射(PEI),经导管肝动脉化疗栓塞(TACE)、放射治疗、免疫治疗、分子靶向治疗等也取得了一定的疗效,但肝癌患者的5年生存率仍未见明显提高,其中重要原因之一是对其发生发展的分子机制知之甚少而未能找到肝癌早期诊断和预后判断的可靠的分子标志物乃至治疗靶点。因此从分子水平探索肝癌发生发展的机制,发现肝癌各分子调控网络的内在规律,仍是肝癌研究中亟待解决的重大课题。泛素-蛋白酶系统广泛存在于真核细胞内,参与细胞周期的调控、细胞信号的传导、细胞凋亡等。泛素蛋白酶系统包括泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素链接酶E3等。越来越多的研究证明,泛素结合酶E2,与肿瘤的发生发展密切相关。泛素结合酶UBE2C在肺癌、食管癌、乳腺癌等多种肿瘤中高表达,其可以作为食管癌等肿瘤早期诊断和预后判断的分子标志物;UBC13通过激活TAK1-P38信号通路促进乳腺癌的转移。作为泛素结合酶家族中重要的一员,泛素结合酶 E2T(ubiquitin-conjugating enzyme E2T,UBE2T),在多种肿瘤的发生发展中起到了重要的调控作用。Takata等首次发现UBE2T在肺癌、膀胱癌、前列腺癌等癌组织中相对于其对应癌旁组织表达上调;之后Yuichi等发现UBE2T可通过调节细胞的DNA损伤修复途径,引起肿瘤的发生发展;近年来研究表明,在肺癌中,与癌旁组织相比UBE2T在肺癌组织中表达增高,且过表达UBE2T的肺癌细胞具有显著增高的克隆形成能力,提示UBE2T的过表达与肺癌的发生密切相关;在乳腺癌中,抑制UBE2T的表达可阻断BRCA1的降解,从而抑制乳腺癌细胞的增殖,而且UBE2T的表达与乳腺癌患者预后明显相关;在乏氧条件下,下调UBE2T的表达可增加肿瘤细胞的化疗敏感性。这些研究结果提示,UBE2T作为一个癌基因在多种肿瘤的形成发展过程中发挥着极其重要的作用。本课题组2010级硕士研究生曹传辉通过组织芯片及免疫组织化学的方法检测了 UBE2T在消化系统肿瘤中的表达,发现UBE2T在肝癌、食管癌、胃癌、大肠癌等消化系统肿瘤中表达增加。之后曹传辉重点研究UBE2T在肝癌中的表达情况,其通过qRT-PCR及western blot的方法证明了 UBE2T在肝癌组织中高表达,用免疫组织化学方法检测UBE2T在133例肝癌石蜡标本中的表达,发现UBE2T在肝癌组织中的阳性率为60%而在癌旁组织中的阳性率仅为13%。生存分析发现UBE2T可以作为肝癌独立预后的危险因素。本研究为曹传辉的后续研究,重点探讨UBE2T在肝癌中的生物学作用及促进肝癌细胞增殖的分子机制。我们首先通过基因芯片技术、聚类分析及SAM等分析方法筛选出在肝癌中差异表达的mRNA,发现UBE2T在肝癌中高表达,在曹传辉研究的基础上,我们将肝癌患者样本量扩大到171例,通过免疫组织化学技术分析了 UBE2T在171例肝癌石蜡标本中的表达,应用Kaplan-Meier及COX比例风险回归分析明确了 UBE2T对肝癌患者预后的影响,然后通过在肝癌细胞株中将UBE2T过表达或干扰,探讨UBE2T对肝癌细胞增殖、侵袭等生物学过程的影响,最后通过寻找UBE2T调控的细胞信号传导信号通路,阐明UBE2T促进肝癌细胞增殖的分子机制,为肝癌"精准医疗"奠定新的理论基础。方法1、肝癌组织中UBE2T表达水平的分析利用免疫组织化学技术检测171例原发性肝癌患者石蜡组织标本中UBE2T的表达水平并进行评分,采用Spearman秩相关分析UBE2T表达与原发性肝癌各临床病理参数之间的相关性;应用Kaplan-Meier生存分析法分析UBE2T对肝癌患者预后的影响;运用COX比例风险回归模型对各临床病理参数、UBE2T表达与原发性肝癌预后的关系进行单因素与多因素分析,明确UBE2T是否可以作为原发性肝癌发病的独立危险因素。2、UBE2T在肝癌细胞中的生物学作用用过表达慢病毒载体Lv-UBE2T或干扰慢病毒载体Lv-shRNA-UBE2T转染肝癌细胞株,构建UBE2T稳定过表达稳定过表达或UBE2T稳定沉默表达的肝癌细胞株,采用western blot与qRT-PCR的方法鉴定转染后UBE2T蛋白在肝癌细胞株中的表达,然后利用CCK-8方法测定肝癌细胞在转染前后其增殖能力有无变化,采用流式细胞仪检测转染前后细胞周期有无变化及凋亡细胞比例的变化,western blot方法检测转染前后凋亡相关蛋白表达改变。进一步通过裸鼠皮下成瘤等体内实验验证UBE2T过表达及干扰对肝癌细胞增殖活性的影响。3、UBE2T促进肝癌细胞增殖的分子机制利用western blot方法检测肝癌细胞株在过表达UBE2T和UBE2T沉默表达前后各细胞信号通路中主要相关蛋白的表达变化,明确UBE2T调控的信号通路,然后通过使用信号通路阻断剂将所筛选的信号通路活性阻断,western blot方法检测肝癌细胞株在UBE2T过表达或干扰后该信号通路蛋白表达变化情况,同时采用CCK-8法检测通路抑制剂使用前后两组细胞体外增殖能力的改变。结果1、肝癌组织中UBE2T表达水平的分析免疫组织化学检测171例肝癌石蜡标本中UBE2T的表达,结果发现,与癌旁组织相比,UBE2T在肝癌组织中明显高表达。应用Spearman秩相关分析UBE2T的表达与原发性肝癌临床病理参数之间的关系,其表达与肝癌肿瘤数目(P<0.001)、BCLC分期(P<0.001)、门脉癌栓(P<0.001)、远处转移(P=0.017)等密切相关,与性别、年龄、病理分级、肿瘤大小、复发等无明显相关性。Kaplan-Meier分析UBE2T与原发性肝癌预后的关系,分析结果表明UBE2T与肝癌患者总体预后相关(P<0.001),与肝癌患者无病生存率明显相关(P=0.004)。UBE2T高表达的肝癌患者总的生存时间和无病生存时间比UBE2T低表达的肝癌患者的总生存时间和无病生存时间短。采用COX比例风险回归模型对各临床病理参数、UBE2T表达与原发性肝癌预后的关系进行单因素与多因素分析,分析结果表明UBE2T(HR=1.837,P=0.012)、肿瘤复发(HR=1.516,P=0.048)及门脉癌栓(HR=2.089,P=0.024)均为原发性肝癌患者发病的独立预后因素,为肝癌患者发病的独立保护因素。2、UBE2T诱导细胞周期进展、抑制细胞凋亡、促进肝癌细胞增殖活性我们使肝癌细胞株过表达UBE2T或沉默肝癌细胞株中UBE2T的表达以探讨其生物学功能。运用CCK-8法检测肝癌细胞增殖能力的变化,结果发现肝癌细胞株稳定表达UBE2T后,其增殖能力明显增强;而沉默UBE2T表达后肝癌细胞株的增殖能力明显下降。为了进一步探讨UBE2T的作用,我们将UBE2T过表达的肝癌细胞株与对照组的肝癌细胞株分别接种到裸鼠大腿内侧皮下以观察其皮下成瘤能力,结果表明UBE2T过表达组的肝癌细胞株裸鼠皮下瘤增殖能力明显增强。将UBE2T沉默表达的肝癌细胞株与对照组肝癌细胞株分别接种到裸鼠大腿内侧皮下以观察皮下瘤增殖能力,结果表明UBE2T沉默组肝癌细胞裸鼠皮下成瘤明显减弱。采用流式细胞仪检测UBE2T的siRNA转染前后肝癌细胞周期的变化,结果表明,UBE2T沉默后,SMMC-7721与MHCC-97H细胞的G0/G1期减少,而G2/M期比例增加。采用流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡变化,结果表明,UBE2T沉默后,细胞凋亡明显增加,通过western blot试验检测凋亡相关蛋白,我们发现裂解的PARP、裂解的Caspase3表达在UBE2T敲除后细胞株中显著上调,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下调。以上结果充分证明,UBE2T通过诱导细胞周期进展并抑制细胞凋亡从而促进肝癌细胞增殖活性。3、UBE2T通过激活Akt信号通路促进肝癌细胞的增殖基于上述研究结果,我们进一步探讨了 UBE2T调节肝癌细胞增殖的分子机制。我们通过western blot检测UBE2T过表达或干扰后肝癌细胞中信号通路的变化,发现UBE2T过表达后磷酸化Akt表达显著升高,UBE2T敲除后肝癌细胞中磷酸化Akt表达显著降低。我们进一步检测了 Akt下游的调节分子GSK-3β及GSK-3β下游分子β-catenin的表达,结果表明p-GSK-3β(失活形式)及β-catenin在UBE2T过表达肝癌细胞中显著上调,而在UBE2T敲除后结果相反。这一结果提示UBE2T可能通过Akt/GSK-3β/β-catenin调节肝癌细胞增殖。为了进一步验证上述实验结果,我们利用Akt的信号通路抑制剂MK-2206 2HCL阻断该通路后,通过CCK-8体外增殖实验证明使用MK-22062HCL处理后UBE2T过表达的肝癌细胞增殖能力显著下降。以上实验结果充分证明UBE2T主要通过激活Akt信号通路从而促进了肝癌细胞增殖。结论1、UBE2T在肝癌组织中表达显著增高,可以作为判断肝癌患者预后的有效指标。2、UBE2T诱导细胞周期进展及抑制肝癌细胞凋亡从而促进肝癌细胞增殖活性。3、UBE2T通过激活Akt信号通路从而调节肝癌细胞生物学功能。