背景及目的：　　 肿瘤细胞的一个基本特征是细胞增殖与细胞凋亡的不平衡，而化疗药物杀死肿瘤细胞的主要机制就是诱导细胞凋亡。细胞毒性化学药物治疗(化疗)无选择性，在杀伤癌细胞的同时也杀伤增殖的正常细胞。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinases inhibitors，TKIs)如吉非替尼(Gefitibib，商品名为Iressa)治疗可以使肿瘤缩小。然而在其临床试验和治疗中，仅有一部分非小细胞肺癌(NSCLC)人群对药物有反应。研究发现肺癌化疗敏感性低和吉非替尼的耐药与肿瘤细胞的凋亡耐受相关。Bcl-2家族中BH3-only蛋白在线粒体调节的“内源性凋亡途径”中发挥重要的调节作用，被称为“凋亡增敏蛋白”。其中，促凋亡蛋白Bim被认为在乳腺癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤细胞凋亡过程中发挥了重要作用。因此从肺癌的凋亡耐受及死亡机制着手，研究NSCLC不同治疗反应性的机制、以从中筛选出最适治疗对象进行有针对性的治疗具有重要临床意义。　　 本研究旨在通过探索化疗药物顺铂和TKIs吉非替尼体外诱导非小细胞性肺癌细胞凋亡的分子机制，并进一步探讨Bim在决定非小细胞性肺癌细胞对吉非替尼和顺铂诱导其凋亡的敏感性中的潜在作用，更好地了解非小细胞性肺癌细胞对抗TKIs和化疗药物抵抗的生物学基础，以寻找克服肿瘤细胞对凋亡抵抗的有效途径。　　 第一部分、吉非替尼对肺癌细胞株的生长抑制作用　　 目的：评价吉非替尼对四种人NSCLC细胞株.A549(EGFR野生型)、H1299(EGFR野生型)、PC-9(EGFR突变型)和PC-9/BB4(亚克隆耐药株)的生长抑制作用，以及诱导凋亡与Bim蛋白表达的关系。　　 方法：选取四种非小细胞性肺癌细胞株PC-9，PC-9/BB4，A549，H1299；MTT检测细胞株对吉非替尼的药物敏感性和耐药性：流式细胞仪Annexin-V/PI法检测不同时点的细胞凋亡率：western blot检测细胞株给药前后Bim蛋白表达变化。　　 结果：　　 1、吉非替尼对四种非小细胞肺癌细胞株均有明显生长抑制作用，并且这种抑制作用呈现出时间依赖性特点(P<0.05)。作用48h后，其IC50值分别为：PC9(0.03-0.05)μmol/L，PC9/BB4(5±0.25)μmol/L，A549(9±0.06)μmol/L，H1299(12.5±0.54)μmol/L(P<0.05)。　　 2、吉非替尼诱导非小细胞肺癌细胞凋亡的变化：药物组的细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)，且随着药物浓度升高凋亡率相应增高，凋亡与药物浓度呈正相关，具有剂量依赖性。选用1μmol/L吉非替尼不同时点(0h，24h，48h，72h)处理PC-9细胞并对其细胞凋亡率进行检测，可见吉非替尼诱导NSCLC细胞凋亡具有时间依赖性。1μmol/L吉非替尼作用下A549、H1299以及PC-9/BB448h凋亡率均低于5％，再次说明这三株细胞株对顺铂诱导的凋亡具有相对抵抗性。　　 3、吉非替尼诱导非小细胞肺癌细胞凋亡前后Western blot结果：给予吉非替尼敏感株PC-91μmol/L吉非替尼，发现Bim在未给药时表达并不明显，随着药物作用时间的延长，细胞株凋亡率随之增加，BimEL、BimL的表达也随之增强。而存耐药株PC-9/BB4中发现其凋亡情况小明显，与之相关的Bim表达亦不明显。　　 结论：吉非替尼诱导不同的NSCLC细胞株凋亡，Bim表达水平与吉非替尼诱导NSCLC敏感株PC-9细胞凋亡呈正相关，即随着Bim蛋白表达水平的下调，吉非替尼诱导PC-9细胞的凋亡率也明显降低。内在凋亡途径有可能通过Bim影响了肺癌细胞株对于吉非替尼的反应性。特异性“沉默”Bim的转录，可以使吉非替尼诱导的敏感PC-9细胞株凋亡减少，从而实际上避免了吉非替尼在该细胞株诱导的凋亡。相比之下，对照siRNA的细胞在吉非替尼作用下继续进行细胞凋亡反应。在每三个独立的实验中，吉非替尼在PC-9细胞诱导的细胞凋亡百分比明显有统计学意义(P=0.001)，从而证实Bim是吉非替尼诱导细胞凋亡的必须因子。　　 第二部分、BimSiRNA对吉非替尼诱导肺细胞株凋亡的影响　　 目的：评价Bim siRNA对吉非替尼诱导吉非替尼敏感株(EGFR突变型)和吉非替尼获得性耐药株凋亡的影响。　　 方法：应用RNAi技术，以化学合成的Bim siRNA(小干扰RNA)体外转染，流式细胞术、western blot检测转染前后肺癌细胞凋亡、Bim蛋白、Bcl-2,pAKT等指标的变化及关系。　　 结果：　　 1、随着siRNA特异性“沉默”Bim基因抑制Bim蛋白的表达，吉非替尼诱导PC-9细胞的凋亡率也明显降低。经统计学分析，两者存在相关性(P<0.05)。相比之下，对照siRNA的细胞在吉非替尼作用下继续进行细胞凋亡反应。　　 2、转染后，吉非替尼诱导后PC-9/BB4细胞的Bim蛋白表达水平明显降低而NSCLC细胞的凋亡率有少量降低。　　 3、特异性siRNA“沉默”Bim基因前后以及吉非替尼诱导PC-9细胞凋亡前后的Bcl-2蛋白表达水平和pAKT的蛋白水平也无明显差异。　　 结论：Bim是吉非替尼诱导敏感株细胞凋亡的必须因子。PI3K/AKT途径和Bcl-2可能与TKI对于肺癌的耐药无关。　　 本研究在一定程度上证实了Bim在吉非替尼诱导的NSCLC细胞凋亡中发挥了关键作用，同时提示我们是否可以将Bim作为临床治疗NSCLC的分子靶点或联合其他药物进行特异性靶向治疗，为NSCLC的治疗开辟新的思路。　　 第三部分、Bim在顺铂诱导肺癌细胞株死亡中的作用　　 目的：探讨Bim表达在顺铂诱导肺癌细胞株死亡中的作用。　　 方法：采用不同浓度的顺铂不同时间处理体外培养上述四种非小细胞性肺癌细胞株。MTT检测细胞株对顺铂的药物反应性：流式细胞仪Annexin-V/PI法检测不同时点的细胞凋亡率：western blot检测细胞株给药前后Bim蛋白表达变化；在PC-9和PC-9/BB4中采用siRNA技术特异性“沉默”，Bim基因；Western blot分别检测“沉默”Bim基因前后顺铂诱导细胞株中的Bim蛋白的表达水平变化。Annexin V-PI染色流式细胞仪检测顺铂诱导的细胞凋亡水平。　　 结果：顺铂诱导非小细胞肺癌细胞死亡具有时间和剂量依赖性，作用48h后，其IC50值分别为：PC9(8±0.02)μg/ml，PC9/BB4(5±0.12)μg/ml，A549(6±0.23)μg/ml，H1299(8±0.26)μg/ml。剂量8μg/ml的顺铂处理相同时间(48h)后的A549、H1299、PC-9和PC-9/BB4凋亡率(包括早期和晚期)分别为58.7％、47.8％、45.3％、59.3％。BH3-only蛋白Bim的表达上调和移位活化参与了顺铂诱导的非小细胞性肺癌细胞凋亡。以8μg/mL顺铂分别处理PC-9以及PC-9/BB4后对Bim蛋白的表达水平进行检测，Bim蛋白的表达较阴性对照组均有明显增强，组间差异无显著意义(P>0.05)。特异性siRNA“沉默”Bim基因后，顺铂诱导后PC-9和PC-9/BB4细胞株的Bim蛋白表达水平明显降低。随着siRNA特异性“沉默”Bim基因抑制Bim蛋白的表达，顺铂诱导PC-9细胞的凋亡率有少量降低，但是PC-9/BB4细胞株中凋亡率没有明显降低。因此沉默Bim表达并不能显著降低顺铂诱导细胞的凋亡率，考虑与顺铂除诱导非小细胞肺癌细胞凋亡外还诱导其它形式的细胞死亡有关。　　 结论：Bim在顺铂诱导的非小细胞肺癌细胞凋亡中起到一定作用，是决定非小细胞性肺癌细胞对顺铂诱导其凋亡的敏感性的机制之一，因此调节Bim的表达可以影响细胞株对于顺铂的反应性。但是由于顺铂通过破坏细胞膜的完整性即诱导细胞坏死和诱导细胞凋亡来诱导细胞死亡，并非唯一的决定性的因素。