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新生儿期因肠梗阻产生的内毒素经常造成机体多个器官的损伤,其中以新生儿急性肺损伤(acute lung injury, ALI)最为常见,临床表现为缺氧、肺部湿啰音、粉红色泡沫痰,进行性呼吸困难,严重者可展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS),进而诱发多脏器功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome MODS),病死率达到44%以上,所以防治ALI具有非常重要的临床意义。目的本研究拟采用腹腔注射内毒素的方法建立新生大鼠急性肺损伤动物模型,通过观察戊乙奎醚(penehyclidine hydrochloride,PHC)对细胞色素C (Cyt-c)、半胱氨酸的天冬蛋白酶-3(Caspase-3)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的调节,并结合肺组织病理学变化,探讨戊乙奎醚对急性肺损伤新生大鼠的保护作用机制,为临床治疗提供理论依据。材料与方法1研究对象40只健康7日龄Wistar大鼠(体重12-18g),由河南省实验动物中心提供。2实验方法2.1动物模型建立采用腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的方法复制新生大鼠急性肺损伤动物模型,将动物仰卧固定在动物手术台上,用1ml注射器于腹部下方腹腔注射LPS 5 mg ? kg。实验后将大鼠置笼内,可自由活动、不禁食水。根据光学显微镜下肺组织形态学结构的改变确立新生大鼠急性肺损伤动物模型建立成功。2.2动物分组将40只新生Wistar大鼠利用随机排列表随机分为4组(n=10)：①生理盐水对照组(NS组),腹腔注射生理盐水0.5ml；②急性肺损伤模型组(LPS组),LPS 5 mg ? kg加生理盐水至0.5ml腹腔注射；③低剂量盐酸戊乙奎醚十预组(PL组),腹腔注射盐酸戊乙奎醚0.1 mg?kg,30min后注射LPS；④高剂量戊乙奎醚干预组(PH组),腹腔注射盐酸戊乙奎醚1.0mg?kg,30min后注射LPS。各组腹腔注入液体总量均为0.5ml,不足者以生理盐水补足。以上四组动物均于腹腔注射LPS 6h后,麻醉下心脏取血,离心取上清液置-20。C冰箱保存,留取肺组织标本,4%甲醛溶液固定2.3标本采集与处理2.3.1血标本采集各组于术后6h,取出经上述处理的动物,先将动物麻醉后四肢展开仰卧固定于鼠板上,按常规碘酒、酒精消毒后无菌迅速打开胸腔、暴露心脏,用针头刺入右心室,迅速吸取血液置子弹头试管内。所取血标本应先静置20 min,于室温下离心(3000r?min, 10min)取上清液即血清装入子弹头试管后,置-20℃冰箱保存。2.3.2肺组织标本采集心脏取血后,立即经右心室用无菌生理盐水快速冲洗后取出肺脏,取左肺组织、放置于4%甲醛溶液中固定24小时。酒精梯度脱水、石蜡包埋、切厚度5μm切片做HE染色,待光镜检查；同样方法取右肺组织,固定、脱水、包埋、切片待Cyt-c、Caspase-3检测。2.4检测指标2.4.1肺组织学检查取左肺行石蜡包埋,每个石蜡块分别以4μm厚度切片五次,行HE染色,光镜下观察肺组织病理形态学改变。2.4.2大鼠血清学检测应用黄嘌呤氧化酶法测定大鼠血清SOD的含量,硫代巴比妥酸法测定血清MDA的含量。2.4.3肺组织凋亡蛋白检测应用免疫组织化学法测定各组肺组织中Cyt-c和Caspase-3的表达。3统计学处理应用SPSS12.0软件统计处理数据,其中计量资料以均数±标准差表示,各组均数之间的比较采用单因素方差分析,均数之间的两两比较采用q检验。其中P<0.05表示有显著的统计学意义。结果1.一般情况观察：LPS组新生大鼠腹腔注射LPS后病态明显,蜷缩,体表湿冷,逐渐表现活动减少、呼吸急促、呼吸窘迫,4h后部分新生大鼠出现紫绀。PL组和PH组皆有活动减少、呼吸加快等情况,PL组有呼吸窘迫、紫绀的情况,比LPS组轻微,PH组上述表现不明显。NS组没有上述表现。2.光镜观察：NS组肺泡结构完整,肺泡间隔均匀一致,肺泡腔清晰,无渗出液；LPS组肺间质内可见大量中性粒细胞浸润,肺泡隔增厚,肺泡壁水肿,部分肺泡结构破坏严重,肺泡内可见大量红细胞和炎症细胞,部分肺泡腔内见渗出、水肿、出血；PH组肺泡结构存在,中性粒细胞浸润明显减轻,肺泡内可见少量红细胞；与LPS组相比较,PL组肺损伤稍有减轻。3.与NS组相比较,LPS组、PL组及PH组肺组织Cyt-c和Caspase-3表达水平均升高(P<0.05)；与LPS组相比较,PL组、PH组肺组织Cyt-c和Caspase-3表达水平均降低(P<0.05)；与PL组相比较,PH组肺组织的Cyt-c和Caspase-3表达水平均明显降低(P<0.05)。4.与NS组相比较,LPS组、PL组及PH组肺组织MDA含量均升高(P<0.05)、SOD含量均降低(P<0.05)；与LPS组比较,PL组和PH组肺组织MDA含量均降低(P<0.05)、SOD含量均升高(P<0.05)；与PL组比较,PH组肺组织MDA含量降低(P<0.05)、SOD含量升高(P<0.05)。结论戊乙奎醚可以抑制急性肺损伤新生大鼠的脂质过氧化损伤,进而减轻肺组织细胞凋亡,抑制急性肺损伤的发展,其机制与抑制肺组织线粒体内Cyt-c、Caspase-3蛋白的表达,降低血清MDA含量、增加血清SOD的含量有关。