背景胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,尽管当前在胃癌的诊断和治疗技术方面已经取得了很大进步,但肿瘤的高侵袭性和转移率使胃癌的预后仍较差。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一种微需氧革兰氏阴性杆菌,流行病学、病理学以及体外试验均表明,H.pylori感染是胃癌发生的重要危险因素之一。近年来不断有研究探讨H.pylori感染与胃癌预后的关联,但仍缺乏一致结论。微小RNA(microRNAs,mi RNAs)是一类长约18~22nt的单链非编码RNA,参与调节细胞发育、代谢、增殖、凋亡、分化等生命活动,越来越多的证据表明miRNA在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。本课题拟探讨H.pylori感染对胃癌患者预后的影响及其可能的分子机制。目的(1)采用前瞻性队列研究方法探讨H.pylori感染与胃癌预后之间的关联;(2)阐明H.pylori阳性和H.pylori阴性胃癌组织的差异miRNA;(3)阐明差异表达的miR-143-3p对胃癌生物学行为的影响及其作用机制,为临床胃癌患者的个体化治疗提供理论依据,也为新药的研发提供新的分子靶点。方法(1)课题组前期已建立了胃癌前瞻性研究队列,纳入自2007年至2009年在安徽医科大学第一附属医院接受根治性手术的原发性胃癌患者261例,本研究采用免疫组化方法检测H.pylori在胃癌组织和癌旁组织的表达,用卡方检验分析H.pylori感染与胃癌患者临床病理特征的关系,用kaplan-meier方法绘制生存曲线,并比较h.pylori阳性和h.pylori阴性胃癌患者的生存情况,通过cox单因素和多因素方法探讨h.pylori感染对胃癌患者总生存(overallsurvival,os)和无病生存(disease-freesurvival,dfs)的影响;(2)从胃癌队列中选取42对胃癌组织及其配对癌旁组织标本,其中胃癌组织和癌旁组织h.pylori均阳性的21例,与其性别、年龄匹配的胃癌和癌旁组织h.pylori均阴性的21例。采用试剂盒提取石蜡组织样品中的总rna,采用μparaflo@微流体芯片分别检测h.pylori阳性的胃癌组织、h.pylori阴性的胃癌组织、h.pylori阳性的癌旁组织和h.pylori阴性的癌旁组织mirna表达谱,通过t检验比较两组间mirna的表达,从而筛选出h.pylori阳性和阴性的胃癌组织差异表达的mirna,以及h.pylori阳性和阴性的癌旁组织差异表达的mirna。选取差异显著的mirna进一步采用qrt-pcr进行验证,以明确h.pylori阳性和h.pylori阴性胃癌的差异mirna。(3)进一步选取h.pylori阳性和阴性胃癌组织表达显著差异的mir-143-3p深入研究,采用qrt-pcr检测42例胃癌组织和癌旁组织mir-143-3p的表达,采用qrt-pcr检测mir-143-3p在正常胃上皮细胞和胃癌细胞中的表达,选取合适的细胞进行功能研究。转染mir-143-3pmimics/inhibitors到不同胃癌细胞,通过cck-8方法检测细胞增殖的变化,采用流式细胞术检测细胞凋亡的变化,采用transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力的变化。进一步通过生物信息学分析软件预测mir-143-3p下游可能的靶基因,采用免疫组化方法检测胃癌组织靶基因的表达,分析mir-143-3p和靶基因的相关性,体外研究转染mir-143-3pmimics/inhibitors到不同胃癌细胞,采用qrt-pcr检测靶基因mrna的变化,采用westernblot检测靶蛋白的变化。通过转染靶基因特异性的sirna下调靶基因的表达,分析细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的变化。结果(1)经免疫组化检测,188例(72.0%)患者h.pylori阳性,73例(28.0%)h.pylori阴性。h.pylori感染与年龄、生存情况和复发情况相关。(2)h.pylori阳性胃癌患者术后平均os为55.2个月(95%ci=53.4~56.9),较h.pylori阴性胃癌患者45.1个月(95%ci=42.2~47.9)延长。h.pylori阳性胃癌患者术后平均dfs为53.9个月(95%ci=51.8~56.0),较h.pylori阴性胃癌患者43.7个月(95%ci=40.4~47.0)延长。经cox多因素分析结果仍显示h.pylori阳性患者有更长的os(hr=0.485,95%ci=0.265~0.889,p=0.019)。(3)采用芯片比较h.pylori阳性和阴性的胃癌组织mirna表达情况,结果显示共有43个mirnas存在显著差异表达。相对于h.pylori阴性的胃癌组织,在h.pylori阳性的胃癌组织上有5个mirnas显著上调,38个mirnas显著下调。进一步通过qrt-pcr验证结果示:mir-100-5p,mir-143-3p和mir-145-5p在h.pylori阳性胃癌组织的表达水平分别是h.pylori阴性胃癌组织的1.24倍,2.1倍和1.64倍,mir-4514在h.pylori阴性胃癌组织的表达水平是h.pylori阳性胃癌组织的2.13倍,与芯片结果趋势一致。(4)同时采用芯片比较h.pylori阳性和h.pylori阴性的癌旁组织mirna表达情况,结果显示共有7个mirnas存在明显差异表达。相对于h.pylori阴性的癌旁组织,在h.pylori阳性的癌旁组织上有2个mirnas显著上调,5个mirnas显著下调。通过qrt-pcr进一步验证结果示:mir-148a-3p,mir-30b-5p和mir-26b-5p在h.pylori阳性癌旁组织的表达水平分别是h.pylori阴性癌旁组织的1.71倍,1.30倍和1.25倍,与芯片结果趋势一致。(5)mir-143-3p在73.8%(31/42)的胃癌组织中表达水平显著下调,mir-143-3p的低表达与更晚的分期以及淋巴结转移有关。与正常胃上皮细胞ges-1相比,mir-143-3p在胃癌细胞sgc-7901、hgc-27、mgc-803、ags、mkn-45、bgc-823中的表达均显著下调(p<0.001)。体外选取内源性mir-143-3p表达水平最高的sgc-7901细胞和相对最低的bgc-823细胞作为一对模型细胞,来进行后续功能学实验。对bgc-823细胞,上调mir-143-3p的表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡;对sgc-7901细胞,下调mir-143-3p的表达可促进细胞增殖、迁移和侵袭能力,抑制细胞凋亡。(6)经生物信息学分析软件预测,rictor和akt2是mir-143-3p可能的靶基因,检测42例胃癌组织及癌旁组织rictor和akt2的表达,rictor在胃癌组织阳性率为50.2%,在癌旁组织阳性率为26.8%;akt2在胃癌组织阳性率为71.4%,在癌旁组织阳性率为23.8%。rictor的表达与mir-143-3p呈负相关,相关系数r=-0.340,p=0.028;akt2的表达与mir-143-3p也呈负相关,相关系数r=-0.422,p=0.005。(7)转染mir-143-3pmimics使胃癌细胞bgc-823内源性rictormrna和蛋白的表达显著下调,转染mir-143-3pinhibitor可导致胃癌细胞sgc-7901rictormrna和蛋白的表达显著上调。类似的,转染mir-143-3pmimics可以下调bgc-823细胞内源性akt2mrna和蛋白的表达水平,转染mir-143-3pinhibitor可以上调sgc-7901细胞内源性akt2mrna和蛋白的表达水平。(8)转染rictor和akt2特异性sirna干扰rictor和akt2表达,均可抑制bgc-823和sgc-7901胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。结论(1)h.pylori在癌旁组织表达高于胃癌组织,总体阳性率为72.0%;h.pylori感染与胃癌患者年龄有关,低龄患者其h.pylori感染更为常见。h.pylori阳性胃癌患者术后os优于阴性患者,h.pylori感染是行根治性切除胃癌患者的独立、有利预后因素。h.pylori阴性的胃癌患者术后需要更严格的随访与更积极的抗肿瘤治疗。(2)h.pylori阳性和阴性的胃癌组织共有43个mirnas存在显著差异表达,经qrt-pcr验证,mir-100-5p,mir-143-3p和mir-145-5p在h.pylori阳性胃癌组织的表达明显上调,mir-4514在h.pylori阳性胃癌组织的表达明显下调。(3)h.pylori阳性和阴性的癌旁组织共有7个mirnas存在明显差异表达,经qrt-pcr验证,mir-148a-3p,mir-30b-5p和mir-26b-5p在h.pylori阳性的癌旁组织的表达明显上调。(4)mir-143-3p在胃癌组织和胃癌细胞中均为低表达,其表达水平与肿瘤分期和淋巴结转移有关。过表达mir-143-3p可抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移,促进胃癌细胞凋亡。(5)生物信息学分析预测Rictor和AKT2是miR-143-3p可能的靶基因,Rictor和AKT2在胃癌组织显著高表达,且表达水平与miR-143-3p呈负相关。miR-143-3p可负向调控胃癌细胞中Rictor及AKT2 mRNA和蛋白表达水平。下调Rictor和AKT2的表达,可抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移,促进胃癌细胞凋亡,发挥与miR-143-3p mimics类似的功能。(6)miR-143-3p通过调控Rictor和AKT2基因发挥抑癌基因的作用,有待荧光素酶报告实验来进一步证实。