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植物基因工程经过二十多年的发展取得令人瞩目的成绩,迄今为止,全世界获得转基因植物近200种。已有近1000余例转基因植物被批准进入田间试验,涉及的植物物种有50多个,已批准了48种转基因植物进行商业化生产。在转基因药用植物方面,我国已经在枸杞、半夏等多种中草药中实现了外源基因的表达。抗菌肽(antimicrobial peptides,AP)是一类小分子的阳离子抗菌活性肽,对细菌有很强的杀伤作用,某些抗菌肽对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等有杀灭作用,甚至能提高免疫力、加速伤口愈合过程。其独特的作用机理,广谱抗微生物活性,被誉为天然抗生素。目前已有将抗菌肽基因转入到烟草、水稻、林木、蔬菜、果树、和中草药等植物中的报道。鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb)为三白草科蕺菜属植物蕺菜的全草。具清热解毒、消痈排脓、利尿通淋等功能。用于痰热喘咳、热痢、热淋、痈肿疮毒等症。人工栽培后,由于其生长环境发生改变,抗病虫害能力有所降低,病虫害发生普遍且较严重,直接影响了鱼腥草的质量和产量。将外源抗菌肽基因转入鱼腥草中可以提高其抗病虫害的能力,增强其抗菌活性。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒(Tumor inducing plasmid)转化系统是目前研究得最多、理论机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化系统之一。本实验应用根癌农杆菌介导法,将外源抗菌肽基因Cecropin B和NP-1融合基因转化到鱼腥草中。并摸索了二种不同根癌农杆菌EHA105与LBA4404转化鱼腥的条件。1实验研究1.1构建抗菌肽植物表达载体pCAMBIA1305.2-CN将本实验室已构建好的表达载体pBI121-CN上的目的基因CN与花椰菜花叶病毒启动子共同切下,插入到质粒pCAMBIA1305.2多克隆位点处,构建植物表达载体pCAMBIA1305.2-CN。实验中通过双酶切鉴定、PCR鉴定与DNA测序鉴定表明,重组质粒pCAMBIA1305.2-CN上的Cecropin B/NP-1融合基因的序列与原设计的目的基因序列一致,证明抗菌肽Cecropin B/NP-1融合基因的植物表达载体pCAMBIA1305.2-CN已构建成功。1.2构建农杆菌EHA105/pCAMBIA1305.2-CN工程菌将植物表达载体pCAMBIA1305.2-CN转化到农杆菌EHA105中。煮沸法提取EHA105/pCAMBIA1305.2-CN中质粒pCAMBIA1305.2-CN,进行PCR鉴定,表明EHA105/pCAMBIA1305.2-CN工程菌构建成功。1.3根癌农杆菌EHA105/pCAMBIA1305.2-CN转化鱼腥草及条件的优化根癌农杆菌EHA105/pCAMBIA1305.2-CN在不同温度、不同预培养时间、不同共培养时间、不同乙酰丁香酮浓度等条件下转化鱼腥草,通过GUS检测分析转化情况,优化转化条件。应用农杆菌EHA105/pCAMBIA1305.2-CN转化鱼腥草,在25～26℃、预培养5d、共培养3d、将转化后的叶片置于添加了200μmol/L乙酰丁香酮的共培养培养基中等条件下,初步获得鱼腥草抗性幼芽。1.4构建农杆菌LBA4404/pBI121工程菌与LBA4404/pBI121-CN工程菌将植物表达载体pBI121与pBI121-CN转化到农杆菌LBA4404中。煮沸法提取LBA4404/pBI121-CN中质粒pBI121-CN,提取LBA4404/pBI121中质粒pBI121进行PCR鉴定,表明LBA4404/pBI121-CN工程菌与LBA4404/pBI121工程菌构建成功。1.5根癌农杆菌LBA4404/pBI121转化鱼腥草及条件的优化根癌农杆菌LBA4404/pBI121在不同温度、不同预培养时间、不同共培养时间、不同乙酰丁香酮浓度等条件下转化鱼腥草,通过GUS检测分析转化情况,优化转化条件。应用农杆菌LBA4404/pBI121-CN转化鱼腥草,在23℃、预培养6d、共培养7d、将转化后的叶片置于添加了200μmol/L乙酰丁香酮的共培养培养基中等条件下,初步获得鱼腥草抗性植株。2结论通过对不同碱型的农杆菌与其转化鱼腥草转化条件的摸索,初步建立了农杆菌介导的外源抗菌肽基因转化鱼腥草的转化体系,为下一步研究抗菌肽基因在鱼腥草植株中的表达,及转基因鱼腥草的抗菌性能等奠定了基础,为抗菌肽在中药植株中表达提供理论和应用依据。