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雷帕霉素(Rapamycin)是一种天然的大环内酯类抗生素,具有各种各样的生物活性,例如抗真菌、免疫抑制剂、抗肿瘤、神经保护和抗衰老等。在临床上被用于器官移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗,相比环孢菌素而言,雷帕霉素表现出更强的临床药用价值和更低的毒副作用,因此雷帕霉素的研究备受学术界和各大制药企业的青睐与关注。1.根据以前文献报道[1],莽草酸的添加能够提高雷帕霉素的产量,本文从吸水链霉菌诱变菌株U2-3D9出发,进行新一轮紫外诱变筛选获得一株雷帕霉素莽草酸耐受菌株U3-SD,其产量达到389.7 mg/L,相比诱变菌株U2-3D9(273 mg/L),雷帕霉素产量提高了42.7%。2.虽然通过紫外诱变获得了一株雷帕霉素高产菌株,但是雷帕霉素高产机制仍然不清楚,而且通过比较吸水链霉菌诱变菌U3-SD与原始菌ATCC 29253胞外发酵特性,结果仍然无法揭示雷帕霉素的高产机制。为了剖析雷帕霉素生产机理并用于强化其合成,利用氨基酸代谢轮廓分析比较原始菌与诱变菌株U3-SD之间胞内氨基酸库变化来揭示限制雷帕霉素的合成因素。首先在气相色谱-质谱联用仪的检测下86种代谢物被鉴定,然后采用主成分分析、层聚类分析和偏最小二乘法分析发现原始菌和诱变菌之间存在代谢差异,同时发现与雷帕霉素合成相关的潜在生物标志物有22种,最后在此基础上通过代谢途径分析发现氨基酸代谢在雷帕霉素合成中具有重要的作用,包括赖氨酸、缬氨酸、色氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、精氨酸和鸟氨酸。3.在氨基酸代谢轮廓分析指导下,采用HPLC检测细胞内上述7种氨基酸胞内绝对含量,发现诱变菌细胞内氨基酸代谢供应不足,即“氮饥饿现象”,且与原始菌之间浓度差异最显著的是赖氨酸。为了验证赖氨酸代谢是雷帕霉素合成的关键代谢模块,采用实时荧光定量PCR和酶活检测分析赖氨酸代谢途径上的关键酶(二氢吡啶二羧酸合酶、丙酮酸羧化酶和赖氨酸环化脱氨酶),结果发现诱变菌赖氨酸代谢途径上关键酶的基因转录水平和酶活均提高了,表明这三个酶与雷帕霉素合成具有正相关性,在理性指导下通过添加不同浓度的赖氨酸进行雷帕霉素的高效发酵,结果当添加5 g/L赖氨酸时,诱变菌株U3-SD的雷帕霉素产量从389.7 mg/L上升至435.7 mg/L。