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纺锤体检测点（Spindle Assembly Checkpoint,SAC）是细胞周期的监控机制,在有丝分裂过程中能阻止未成熟的姐妹染色单体分离以确保遗传物质均匀地分配到子代细胞中,从而保证遗传的稳定性。越来越多的研究发现SAC在肿瘤的发生、发展中扮演着重要角色,已成为肿瘤治疗的重要靶点。有丝分裂阻滞缺陷蛋白2（Mitotic Arrest Deficient Protein 2,Mad2）是SAC的关键蛋白,也是多态性蛋白家族中研究最广泛的成员之一。Mad2有两种不同的天然构象:有潜在活性的开放型构象（Open Mad2,O-Mad2）和有活性的关闭型构象（Closed Mad2,C-Mad2）,两种构象间可以转变。当SAC激活时C-Mad2能直接与有丝分裂后期促进复合物（Anaphase Promoting Complex/Cyclosome,APC/C）的活化因子细胞分裂周期蛋白20（Cell Division Cycle Protein 20,Cdc20）结合,抑制APC/C的活性,进而阻止有丝分裂过程中未成熟的姐妹染色单体分离。Mad2构象间的转变及与Cdc20间的相互作用对SAC发挥其生物学功能至关重要,是目前Mad2功能研究的热点。本论文中,对O-Mad2和C-Mad2折叠的热力学及动力学研究,有助于理解这两种构象发挥不同生物学功能的机理;对O-Mad2和C-Mad2构象转变路径的研究为调控Mad2在SAC发挥功能提供理论指导;对Mad2与Cdc20相互作用的热力学、动力学过程及与Cdc20不同突变体间相互作用的研究,有助于理解这两者相互作用的机理,并为调控Mad2与Cdc20的功能提供理论依据。利用大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）表达系统制备了Mad2两种不同构象的蛋白并进行了初步表征。在该过程中首先构建了人Mad2的重组质粒pQE30-Mad2,再对影响Mad2表达的诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度以及表达时间四个方面进行了系统优化,筛选得到了Mad2高效表达的条件。经镍亲和色谱层析、阴离子交换层析和Superdex-75凝胶过滤分离纯化,最终制备了O-Mad2和C-Mad2两种不同构象的蛋白。用Western blot和质谱验证了实验中制备的两种不同构象的蛋白。圆二色谱（Circular Dichroism Spectroscopy,CD）实验结果表明制备的这两种构象的蛋白均具有正确的二级结构。利用盐酸胍（Guanidine Hydrochloride,GdnCl）诱导的化学变性实验和热变性实验系统研究了O-Mad2和C-Mad2的热力学稳定性和折叠/解折叠动力学过程。热力学和动力学实验结果均表明C-Mad2比O-Mad2更稳定,这与文献报道一致。进一步分析发现,O-Mad2—变性态U—C-Mad2（O-U-C）的转变路径不能解释实验中得到的热力学和动力学结果。根据本论文中的实验结果,建立了O-Mad2和C-Mad2构象转变路径的模型,提出了折叠中间态（Intermediate,I）的存在,其中U和O-Mad2间存在中间态I1,U和C-Mad2间存在中间态I2,中间态结构显著减慢了O-Mad2和C-Mad2两种构象间的转变。荧光各向异性技术是研究蛋白质相互作用的常用技术,本论文中利用该技术系统表征了O-Mad2和C-Mad2与TAMRA-Cdc20121-138间相互作用的热力学及动力学过程,并考察了盐浓度对这两者相互作用的影响。O-Mad2和C-Mad2与TAMRA-Cdc20121-138相互作用的热力学实验结果表明,C-Mad2与Cdc20121-138间的结合力比O-Mad2强,约是O-Mad2的5倍。O-Mad2和C-Mad2与TAMRA-Cdc20121-138相互作用的动力学实验结果表明,C-Mad2与Cdc20121-138的结合速率约是O-Mad2的5倍,而C-Mad2和O-Mad2与Cdc20121-138的解离速率几乎相同,所以C-Mad2与Cdc20121-138的结合比O-Mad2更快且结合力更强,与热力学实验结果一致。用荧光各向异性技术分别表征了突变体Cdc20121-138KR和Cdc20121-138I130K与O-Mad2和C-Mad2间的相互作用。实验结果表明,与野生型Cdc20121-138相比,突变体与Mad2间的结合力均减弱了约70倍,但不同突变体间与Mad2的结合力无明显差异。Cdc20121-138的不同突变体与Mad2间相互作用的研究和盐浓度对Mad2与Cdc20121-138间相互作用影响的研究均表明,Mad2和Cdc20间的相互作用不是通过静电相互作用来实现的,更有可能是通过一种疏水的相互作用。以上研究揭示了Mad2和Cdc20间相互作用的机理。成功构建了Mad2的7个双定点突变体,并以突变体C79A-C106A-T187C（149C-T187C）为例进行了表达、纯化与表征。对149C-T187C表征的结果表明,突变对蛋白的二级结构、热力学稳定性、折叠动力学及与配体Cdc20间的结合均无影响。用荧光染料Alexa Fluor 488（AF488）和Alexa Fluor 647（AF647）对突变体蛋白进行双标记,对标记后蛋白样品表征的结果表明双标记成功,且标记不会影响蛋白的二级结构及热力学稳定性。实验中可以用标记后的突变体蛋白代替野生型Mad2进行研究,建立了用单分子荧光技术研究Mad2的体系,为进一步用单分子荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET）技术研究Mad2构象转变的机理奠定了基础。