胰腺癌是一种高度恶性的消化系统肿瘤,预后极差。在西方国家,胰腺癌排名恶性肿瘤死因的第4位。2011年,美国胰腺癌新发病例数为44030例,死亡37660例,5年生存率仅有6%。随着近年来经济的发展,污染的加重,生活习惯的西方化,中国胰腺癌的发病率也逐年上升。据上海市流行病学统计数据,2009年上海市胰腺癌发病率已上升至男性17.28/10万,女性14.04/10万。强烈的局部侵袭能力和早期转移能力是导致胰腺癌病人极差预后的主要原因,大部分胰腺癌患者在得到诊断的时候因发现有局部侵犯或远处转移而不能获得根治性手术切除。胰腺癌的发生发展是多因素在多阶段作用的过程,包括癌基因的活化、抑癌基因的失活以及突变。。随着分子生物学的进展,研究领域的不断开拓,越来越多的新基因和基因的新功能被大家所发现。基于干预相关基因功能的分子靶向治疗给胰腺癌患者带来了曙光。如果将分子靶向治疗和传统治疗方式联合很有可能会改善胰腺癌的预后,提高胰腺癌患者的生存时间和生活质量。醛缩酶A (aldolase A, ALDOA),指参与催化裂解1.6-二磷酸-D-果糖,生成3-磷酸-D-甘油醛和α-二羟丙酮磷酸的酶。是一种几乎存在于一切生物体中并参与其糖酵解的重要酶。醛缩酶A参与了许多细胞功能,如肌肉的维持,横纹肌的收缩,细胞形态和运动的调节,ATP的合成及肌动蛋白丝的组织。ALDOA已被证实在人体绝大部分组织器官均有不同程度的表达,并且在多种恶性肿瘤中异常高表达,其表达高低被认为和多种恶性肿瘤的分化、TNM分期及预后相关。目前的研究表明ALDOA可能通过调控多条信号通路而影响肿瘤的发生、增殖、抗凋亡、侵袭、转移、血管生成、耐药等多个环节。ALDOA很可能作为一个广谱性的标志物,在恶性肿瘤的诊断、治疗及预测预后中发挥巨大作用。目前国内外尚未有ALDOA与胰腺癌发病的相关报道。在本课题中,我们首先通过高通量组织芯片免疫组织化学技术分析了ALDOA在胰腺癌和配对癌旁组织的表达模式,以及ALDOA在癌组织中表达高低与患者临床病理特征的关系和潜在预测预后的价值,证实ALDOA评分和分化及TNM分期相关,并且是胰腺癌独立的预后因素。其次,我们检测了ALDOA在不同胰腺癌细胞系中的表达差异,选取高表达ALDOA的胰腺癌细胞株PANC-1和MIAPaCa-2为研究对象,采用RNA干扰技术,构建ALDOA的RNAi慢病毒载体,并获得了稳定干扰ALDOA表达的胰腺癌细胞株。最后,我们通过体外实验研究抑制ALDOA表达后,胰腺癌细胞的增殖凋亡及侵袭转移能力的变化,证实了干扰胰腺癌中ALDOA的表达,可以抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭转移。ALDOA作为胰腺癌的独立预后因素以及潜在治疗靶点,值得我们进一步研究。第一部分ALDOA在胰腺癌临床组织中的表达及临床意义目的：研究胰腺癌中ALDOA在癌组织和癌旁组织中的表达差异,分析ALDOA与胰腺癌患者临床病理特征及预后的关系。方法：通过组织芯片免疫组化染色检测96对胰腺癌及配对癌旁组织中的ALDOA蛋白水平的表达情况。使用秩和检验分析ALDOA染色评分和CA19-9高低、TNM分期、肿瘤分化、生存时间等临床病理资料的相关性,累计生存时间和累计生存率采用Kaplan-Meier法,生存检验采用Log-rank法,采取Cox比例风险模型进行单因素和多因素分析。结果：组织芯片免疫组化结果提示：ALDOA在胰腺癌组织的表达水平要高于配对癌旁组织(高表达率：癌64/96,66.7%；癌旁32/96,33.3%),ALDOA在胰腺癌组织中主要在细胞浆表达较明显,而在癌旁正常导管中,ALDOA染色较浅,且一般为均匀分布于细胞浆中。胰腺癌组织ALDOA蛋白高表达(染色指数>6)与生存时间短(p<0.001),肿瘤细胞分化差(P=0.026)相关。Kaplan-Meier法分析ALDOA评分高低(p<0.001)、肿瘤分化高低(p<0.001)、TNM分期早晚(P=0.004)的患者生存时间存在统计学差异。进一步行Cox回归多因素分析提示ALDOA是胰腺癌患者术后死亡风险的独立危险因素(HR=2.379,95% CI=1.357-4.170,P=0.002)。结论：在人胰腺癌组织中ALDOA蛋白表达普遍高于癌旁组织,主要表达在胞浆。ALDOA的高表达与的临床病理因素(分化差、TNM分期晚)显著相关。ALDOA染色评分与患者的预后密切相关,是胰腺癌患者术后死亡风险的独立危险因素。第二部分干扰ALDOA表达对胰腺癌恶性潜能的影响目的：构建ALDOA基因特异性shRNA真核表达载体,建立稳定干扰ALDOA表达的胰腺癌细胞,研究干扰A LDO A对于胰腺癌细胞系PANC-1MIAPaC a-2体外增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭能力的影响；初步探索胰腺癌中干扰ALDOA后增殖、转移、周期相关指标的变化。方法：Western blot检测人胰腺癌细胞系中ALDOA的表达,选择高表达ALDOA的细胞系为后续研究对象。设计合成ALDOA基因特异性的shRNA序列,以慢病毒载体pLKO.1 TRC cloning vector为基础构建ALDOA基因特异性shRNA重组真核表达载体。包装生成相应慢病毒并转染胰腺癌细胞系,嘌呤霉素筛选稳定表达重组载体的胰腺癌细胞系。通过CCK-8法检测细胞增殖能力,PI染色法分析细胞周期,平板克隆形成实验比较细胞增殖和群体依赖性变化,细胞划痕实验评估细胞迁移能力。利用Western blot检测E-cadherin, Snail和CyclinDl的表达变化,探索胰腺癌中干扰ALDOA对增值及侵袭转移的影响。免疫组化验证ALDOA与E-cadherin相关性。结果：Western blot结果显示在6株胰腺癌细胞系中PANC-1 和 MIAPaCa-2中ALDOA蛋白含量最高。设计合成的ALDOA基因特异性shRNA单链成功退火形成双链shRNA。用重组质粒包装慢病毒并成功转染PANC-1 和 MIAPaCa-2细胞,采用嘌呤霉素成功筛选获得稳定表达重组质粒的胰腺癌细胞株。CCK-8细胞增殖实验提示,下调ALDOA表达水平后,不同时间点的PANC-1和MIAPaCa-2 细胞系的增殖能力明显减弱。细胞周期分析提示：干扰ALDOA后,人胰腺癌细胞PANC-1和MIAPaCa-2均出现G1增多,G2和S期减少,发生G1期阻滞。平板克隆实验证实ALDOA表达的下调明显抑制了PANC-1和MIAPaCa-2的增殖以及增加了其群体依赖性。细胞划痕实验证实ALDOA表达减少后PANC-1和MIAPaCa-2迁移能力明显减弱。Western blot检测干扰ALDOA后Snail和CyclinDl下调,E-cadherin上调,提示胰腺癌中ALDOA可以通过调控周期、侵袭转移相关基因从而影响胰腺癌的生物学行为。通过免疫组化染色进一步验证ALDOA高表达的组织E-cadherin呈现相对低表达,而ALDOA低表达的组织E-cadherin呈现高表达。回补实验也进一步证明ALDOA与胰腺癌EMT密切相关,并且ALDOA是通过其催化活性的改变影响EMT表型从而影响胰腺癌侵袭转移的。结论：以ALDOA为靶点的RNAi可以有效抑制人胰腺癌细胞PANC-1和MiaPaCa-2的增殖、侵袭和迁移,造成G1期阻滞,有效改善胰腺癌细胞的恶性表型。ALDOARNAi可以下调Sna il口Cyclin D1的表达,上调E-cadherin的表达,并且免疫组化验证进一步表明ALDOA 与 E-cadherin的表达呈现出负性相关。ALDOA是通过其催化活性的改变影响EMT表型从而影响胰腺癌侵袭转移的。创新点1.国内外首次采用高通量组织芯片技术研究ALDOA在胰腺癌和癌旁组织的表达及预后价值。2.国内外首次较系统的研究了ALDOA对胰腺癌增殖、周期、凋亡、侵袭和转移能力的影响。3.将胰腺癌两个热门研究领域代谢与上皮间质转化联系起来。潜在应用价值1. ALDOA可以作为胰腺癌术后患者的独立预后分子预测指标。2. ALDOA作为胰腺癌治疗的分子作用靶点具有广泛的应用前景及研究价值。