研究背景及目的:乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,是女性健康的第一杀手。放射治疗是乳腺癌主要的治疗手段之一,可以显著提高乳腺癌的局部控制率,降低乳腺癌患的复发率,延长患者的生存时间。但放疗抵抗是乳腺癌放射治疗中的一大难题,放疗抵抗往往直接导致乳腺癌治疗的失败。因此阐明乳腺癌放疗抵抗的内在的分子机制,克服乳腺癌的放疗抵抗,对于提高乳腺癌放射治疗效果,具有非常大的帮助。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度超过两百个碱基序列,没有蛋白质编码能力的RNA。LncRNA参与调节生物体内多种生物学过程,与人类疾病发生发展密切相关。研究发现lncRNA参与调控肿瘤细胞的生长、侵袭转移、细胞代谢、化疗敏感性等多种生物学过程,因此lncRNA是潜在的抗肿瘤治疗靶点。例如,LncRNA MEG3在多种肿瘤中表达缺失,在乳腺癌、肝癌等多种肿瘤细胞中MEG3可以抑制肿瘤细胞的生长,MEG3被认为是肿瘤抑癌基因。神经母细胞瘤中lncRNA NBAT-1参与调节神经母细胞瘤细胞的生长和侵袭,同时还能抑制神经前体细胞的分化。LncRNAHNF1A-AS1编码于HNF1A的反义链,研究发现HNF1A-AS1在食管癌中表达水平升高,抑制HNF1A可以抑制食管癌细胞的生长,此外HNF1A-AS1还可以抑制食管癌细胞的侵袭迁移。虽然广泛的研究报道表明lncRNA参与调节肿瘤的各种恶性生物学行为,但是有关lncRNA与肿瘤辐射敏感性的研究却鲜有报道。近年来随着对miRNA研究的不断深入,研究发现miRNA可以靶向调节lncRNA的表达。目前有关于miRNA靶向调节lncRNA的研究,在逐渐的被深入的认识。例如,miR-211可以结合lncRNA loc285194,抑制loc258194的表达,从而抑制结肠癌细胞的生长;miR-17-3b可以直接靶向抑制lncRNAGCASPC促进GCASPC的降解,从而抑制胆囊癌细胞的生长;miR-193b可以直接靶向抑制lncRNAMIR31HG的表达,从而抑制胰腺癌细胞的生长和侵袭。因此miRNA与lncRNA的互相调节,是生物体内重要的调节方式之一。MiR-200c是被广泛研究报道的具有多种功能的miRNA。MiR-200c在多种肿瘤细胞中可以抑制干细胞的产生、上皮间质的转化、侵袭转移、增加肿瘤细胞的化疗敏感性。此外,众多的研究报道发现miR-200c可以增加多种肿瘤细胞的辐射敏感性,miR-200c被认为是一种肿瘤放射增敏因子。研究报道在肿瘤细胞中miR-200c可以靶向抑制TBK1和VEGF-VEGFR2,从而增加肿瘤细胞的放射敏感性;我们先前的研究发现miR-200c可以抑制放疗诱导的自噬,增加乳腺癌细胞的辐射敏感性;此外有研究发现治疗性的输注miR-200c可以明显增加肺癌细胞和食管癌等多种肿瘤细胞的辐射敏感性。既然大量的研究报道均表明miR-200c在肿瘤细胞中具有辐射增敏的作用,并且miRNA可以靶向调节lncRNA表达,因此我们好奇miR-200c是否可以通过靶向调节lncRNA来调节乳腺癌细胞的辐射敏感性。本研究中,我们在低表达miR-200c的乳腺癌细胞中过表达miR-200c,然后行lncRNA芯片检测差异表达的lncRNA,发现过表达miR-200c可以诱导一系列的lncRNA表达发生改变。通过软件生物预测,我们在表达水平下降的lncRNA中,筛选出一系列与miR-200c存在互补结合位点的lncRNA,其中发现lncRNA LINC02582可以促进乳腺癌的辐射抵抗,此外还发现LINC02582是miR-200c的靶基因,进一步的研究发现LINC02582可以通过与USP7蛋白结合,促进CHK1蛋白的去泛素化,提高CHK1的蛋白水平,从而促进乳腺癌细胞的辐射抵抗。方法:1.荧光定量PCR依据Trizol Reagent试剂的说明书进行操作,提取细胞或组织中的总RNA;miRNA 按照逆 PrimeScripTM RT reagent Kit(Takara 037A)说明书进行逆转录,lneRNA或mRNA按照PrimeScriptTMRT Master Mix(Takara 036A)说明书进行逆转录获得cDNA;以cDNA为模板按照TBGreen TMPremix Ex TaqTM(Takara420A)试剂盒说明书进行荧光定量PCR反应。2.SiRNA和plasmid 转染采用阳离子脂质体法进行转染,按照lipofectamine3000操作说明进行操作,采用无血清培养基培养细胞,当细胞融合度达到50%左右时,将mimic,inhibitor,siRNA或plasmid稀释于转染专用培养基Opti-MEMI培养基中,lipofectamine 3000同样用Opti-MEMI培养基稀释后,随后将mimic,inhibitor,siRNA或plasmid溶液混合,室温条件下静置10min后,加入细胞培养板中,培养48h后提取细胞蛋白或RNA或进行后续的功能实验。为有效抑制miR-200c的功能簇,miR-200c inhibitor需与miR-429 inhibitor同时转染。3.慢病毒转染将5×104的细胞接种于24孔板中,培养24h待细胞密度达50%左右,加入实验组慢病毒和对照组慢病毒悬液100μl/孔(MOI=20),并加入终浓度为5ug/ml的polybrene促转染液以增加感染效率,细胞培养24h后更换新鲜的培养基,细胞转染病毒72h后,在荧光显微镜下拍照并计算感染效率,随后加入终浓度为5ug/ml的嘌呤霉素培养细胞,细胞培养约两周后,行荧光定量PCR检测分析。4.细胞辐射及克隆形成实验将处理后的细胞消化成单细胞悬液,并通过细胞计数板计数,然后将细胞按照预定数量接种于6孔板中,总共设有0、2、4、6、8五个剂量组,每个剂量组三个复孔。细胞照射处理后将置于培养箱内继续培养12-20天,期间根据培养液pH值变化适时更换新鲜培养液。当6孔板的板孔中出现肉眼可见克隆时,终止培养细胞培养,先用甲醇固定细胞,然后再用1%结晶紫乙醇溶液染色2-4小时,显微镜下计数含50个细胞以上的克隆数,计算克隆形成率和存活分数,并运用GraphPad Prism 5.0软件进行多靶单击模型曲线拟合。5.细胞免疫荧光实验免疫荧光实验用yH2AX抗体来检测DNA双链的断裂损伤,首先将1×104数的细胞接种在细胞爬片上并培养24小时,然后对细胞行6Gy射线照射处理,照射处理24小时后,先用4%的多聚甲醛固定细胞,然后加入通透液通透细胞,接着用5%BSA封闭处理,再用抗ΥH2AX的特异性抗体4℃孵育过夜,随后用PBS洗掉一抗,最后加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗室温孵育1小时,接着再行DAPI染色处理,最后在荧光显微镜下观察统计ΥH2AX的荧光位点数,其中每组3个复孔,每孔至少计数50个细胞并且每个实验重复3次。6.Western blot实验提取处理后的细胞总蛋白,随后按照BCA法测定所提取的蛋白的浓度,然后在提取的蛋白中加入5×loading Buffer上样缓冲液,并对提取的蛋白进行蛋白变性处理,接着将提取的蛋白行电泳、转膜、封闭处理,随后孵育一抗和二抗,最后采用ECL法在显影仪上进行显影。7.lncRNA表达谱芯片检测lncRNA表达差异本实验中采用Arraystar人类LncRNA芯片V3.0芯片检测差异表达的lncRNA,首先对检测的RNA样品进行RNA量和质量的检测,其中RNA完整性通过标准变性凝胶电泳进行评估;随后行RNA标记和芯片杂交,其中样品标记和芯片杂交根据Agilent One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis实验方案执行;最后行数据分析,使用Agilent Feature Extraction软件获得芯片图,并读值,得到原始数据,使用GeneSpring GX v12.1软件,对原始数据进行Quantile标准化和随后的数据处理,原始数据标准化后经过筛选高质量探针进行进一步分析。两组样品间具有统计学意义的差异表达lncRNA或差异表达mRNA通过P-value/FDR筛选。8.生物信息学预测miR-200c调节的lncRNA对lncRNA芯片检测结果中,表达水平下降的lncRNA,利用生物软件TargetScan和miRBase对miR-200c可能的调节的靶1ncRNA进行预测分析,将这两个数据库预测到的结果取交集以提高预测结果的可信度。9.双荧光素酶报告基因检测法验证LINC02582是miR-200c的靶基因根据生物信息学预测的结果,miR-200c可以与LINC02582结合,我们构建miR-200c假定结合位点的LINC02582以及突变型LINC02582的萤光素酶报告质粒和miR-200c mimics或Negative control共同转染乳腺癌细胞并在转染48h后,依据Promega公司的Dual-Luciferase报告基因检测系统进行样本的萤光素酶活性检测,所有操作均按照试剂盒说明书进行。10.动物实验首先在乳腺癌细胞MDA-MB-231中转染慢病毒,构建稳定抑制LINC02582的乳腺癌细胞株,随后充分消化细胞制成单细胞悬液,将5×106个细胞稀释成0.2ml体积,然后皮下注射于4-6周大小的裸鼠右腿外侧,当肿瘤体积达到150 mm3时,将小鼠随机分入对照组和实验组(每组4只小鼠)。实验组组采用直线加速器对小鼠皮下进行辐射处理,每次照射2Gy,每隔两天一次,每次照射剂量率为500cGy/min,源皮距为100cm,总共照射5次,其中每2天测量一次肿瘤大小,肿瘤体积大小计算公式为:肿瘤体积=(长×宽2)/2,当小鼠肿瘤体积达到2500mm3左右处死小鼠。11.RNA pull down 实验首先构建过表达LINC02582的克隆载体,然后再将表达克隆载体线性化,通过凝胶电泳回收线性化的载体,接着生物素标记LINC02582,随后通过链霉素亲和磁珠与生物素标记的LINC02582结合,往磁珠-RNA混合物中加入细胞裂解液,使磁珠复合物与细胞蛋白充分结合,离心后获取磁珠-RNA-蛋白混合物并变性,接着行凝胶电泳分离磁珠-RNA-蛋白混合物,最后行银染处理,挑取感兴趣的蛋白条带进行行质谱分析。12.质谱分析实验将RNA pull down实验中获取的蛋白条带,行脱色、脱水、酶解等操作后,将肽段萃取液加入上清液中,并行冻干处理,随后将获取的肽段样品行质谱检测,最后用生物软件分析质谱的检测结果。13.RNA免疫共沉淀实验细胞中加入裂解液,冰上刮取后离心获取细胞蛋白,随后用特异性的抗体行免疫共沉淀实验,获取磁珠抗体复合物,然后再加入RNA免疫共沉淀的缓冲液,溶解磁珠抗体复合物,最后通过酶消化和氯仿抽提和乙醇沉淀等步骤提取RNA。14.体外泛素化实验乳腺癌细胞转染siRNA或慢病毒后,加入蛋白酶MG132(5ulmol/ml)处理12h,然后收集细胞,加入裂解液,冰上刮取后,震荡离心提取细胞蛋白;接着用抗CHK1特异性抗体行免疫共沉淀实验,随后收集沉淀的蛋白加入5×loading Buffer上样缓冲液并变性蛋白,最后通过Western Blot实验检测CHK1的泛素化水平。15.乳腺癌组织中CHK1的检测收集乳腺癌组织及瘤周正常组织标本136例,并且经病理确诊全部为浸润性乳腺癌,组织标本首先经4%多聚甲醛固定、包埋、切片,然后进行免疫组化染色,检测组织中CHK1的表达水平。16.乳腺癌组织中miR-200c和LINC02582的检测上述136乳腺癌组织及瘤周正常组织标本,首先经4%多聚甲醛固定、包埋、切片等操作步骤,然后行组织原位杂交,检测组织中miR-200c与LINC02582的表达水平。17.统计学分析本研究中采用SPSS19.0软件进行统计分析,两样本均数的比较采用两独立样本的t检验(Independent-Sample T Test)和单样本t检验,方差齐性检验采用Levene’s Test。Spearman rank correlation 用于分析乳腺癌组织中 miR-200c 与LINC02582表达水平的相关性。乳腺癌标本中miR-200c及LINC02582与CHK1分析采用Pearson卡方检验和Fisher确切概率法;Kaplan-Meier生存曲线及log-rank检验,用于分析乳腺癌病人放疗后的复发时间,其中P值<0.05 认为有统计学意义。结果:1.乳腺癌细胞中miR-200c的表达水平本研究中先用荧光定量PCR分析了乳腺癌细胞株和正常乳腺上皮细胞MCF-10A中miR-200c的相对表达水平,发现miR-200c在基底型乳腺癌细胞株MDA-MB-231和BT549中表达水平明显较管腔型乳腺癌细胞株MCF-7和BT474低。同时我们还发现低表达miR-200c的MDA-MB-231和BT549细胞放疗后的生存分数明显比高表达miR-200c的MCF-7和BT474细胞高,提示miR-200c的表达水平和放射敏感性相关。2.MiR-200c可以增加乳腺癌细胞的辐射敏感性实验发现抑制miR-200c后可以增加乳腺癌细胞辐射处理后的生存分数,而过表达miR-200c后可以降低乳腺癌细胞辐射处理后的生存分数。此外,通过细胞免疫荧光实验我们发现,MDA-MB-231细胞过表达miR-200c后可以增加辐射后诱发的ΥH2AX位点数和ΥH2AX蛋白的表达,DNA损伤可以激活ΥH2AX的磷酸化,参加DNA损伤的修复,因此ΥH2AX位点数和蛋白增加表明miR-200c的过表达抑制放射诱导的DNA损伤修复,促进了 DNA损伤。综上所述miR-200c可以增加乳腺癌细胞的辐射敏感性,miR-200c具有辐射增敏作用。3.MiR-200c可以抑制乳腺癌细胞的上皮间质转化通过转染慢病毒过表达miR-200c后我们观察MDA-MB-231的细胞形态改变,过表达miR-200c后间质型的乳腺癌细胞MDA-MB-231由原来的长梭形转变成椭圆的上皮型。同时Western blot检测发现上皮的标记蛋白E-cadherin表达水平明显升高,而间质的表型Vimentin表达明显下降。由此表明miR-200c过表达后不但增强乳腺癌细胞辐射敏感性,同时还抑制乳腺癌细胞上皮间质的转化。4.MiR-200c可以诱导lncRNA表达谱的改变MDA-MB-231细胞中稳定过表达miR-200c,然后将实验组细胞和对照组细胞行生物芯片分析lncRNA表达谱的改变。芯片结果表明在MDA-MB-231细胞中过表达miR-200c可以诱导一系列lncRNA的表达改变。其中我们发现相对于对照组细胞,实验组细胞中有452条lncRNA表达上调,而有522条lncRNA表达下调。为了更有针对性的筛选出miR-200c相关的lncRNA,我们从下调的lncRNA中用TargetScan和miRBase软件预测与miR-200c存在结合位点的lncRNA,并构建潜在的调节网络。这些与miR-200c存在结合位点的lnRNA很可能是miR-200c直接的靶基因,参与miR-200c的各种生物学调节功能。5.抑制LINC02582可以增加乳腺癌细胞的辐射敏感性在MDA-MB-231和BT549细胞中抑制LINC02582后行克隆形成实验,我们发现抑制LINC02582可以降低辐射后的生存分数,增加乳腺癌细胞对辐射的敏感性;与此同时,我们发现在MCF-7和BT47细胞中过表达LINC02582后行克隆形成实验,可以明显的增加辐射后的生存分数,降低乳腺癌细胞对辐射的敏感性,促进乳腺癌细胞的辐射抵抗。进一步我们行细胞免疫荧光实验发现,MDA-MB-231和BT549细胞抑制LINC02582后,可以明显的增加辐射后的yH2AX位点数和蛋白的表达,表明抑制LINC02582可以促进DNA损伤。为了进一步验证LINC02582对在乳腺癌中具有促进辐射抵抗的作用,我们对MDA-MB-231细胞转染慢病毒稳定抑制LINC02582的表达,然后再在裸鼠皮下注射成瘤,待肿瘤体积长到150mm3左右,对肿瘤行放射治疗处理。实验结果表明,抑制LINC02582组的肿瘤行放射治疗后,生长速度较对照组慢,且肿瘤体积明显较对照组小,肿瘤的重量较对照组轻。动物实验的结果表明抑制LINC02582可以增加乳腺癌细胞的辐射敏感性。6.MiR-200c可以靶向调节LINC02582的表达在MDA-MB-231细胞过表达miR-200c后,可以降低LINC02582的水平,而在MCF-7和BT474中抑制miR-200c后升高LINC02582的表达水平。这些结果表明miR-200c参与调节LINC02582的表达,但过表达或抑制LINC02582对miR-200c的表达水平没有明显影响。由此提示LINC02582是miR-200c的靶基因。我们进一步用常用的软件预测发现在LINC02582的419-441碱基序列中存在这miR-200c的结合位点。荧光素酶报告实验发现突变LINC02582位点上的碱基序列后,可以解除miR-200c对LINC02582的抑制作用。RNA免疫共沉淀结果同样表明,LINC02582可以与miR-200c结合。我们发现过表达miR-200c可以降低LINC02582的稳定性,促进LINC02582的降解。7.乳腺癌组织中miR-200c的表达水与LINC02582负相关我们同时行挽救实验验证LINC02582是否在miR-200c的下游,参与调节乳腺癌细胞的辐射敏感性。实验结果表明过表达LINC02582可以部分逆转nmiR-200c过表达诱导的辐射增敏作用。由分析了 42例乳腺癌组织中miR-200c和LINC02582的表达水平,发现乳腺癌组织中LINC02582与miR-200c的表达水平呈负相关,从而间接证明miR-200c对LINC02582的负性调节。8.LINC02582可以特异性结合USP7蛋白我们行RNA pull down实验联合质谱分析实验找寻能与LINC02582结合的蛋白分子,在众多的结合蛋白中,发现USP7蛋白可以与LINC0258结合。RNA免疫共沉淀实验进一步验证,USP7与LINC02582可以特异性的互相结合。我们行deleted mapping实验。实验结果表明5’端422-783碱基序列是LINC02582与USP7特异性结合所必须的序列片段。9.USP7调节CHK1促进乳腺癌的辐射抵抗在乳腺癌细胞中分别过表达或抑制USP7,发现过表达USP7可以增加CHK1的蛋白水平,而抑制USP7则可以降低CHK1的水平。同时我们发现过表达USP7可以增加辐射后的生存分数,表明USP7可以促进乳腺癌细胞的辐射抵抗。但抑制USP7后乳腺癌细胞辐射后的生存分数降低,细胞免疫荧光实验发现,ΥH2AX的位点明显增多。在乳腺癌细胞中过表达CHK1可以明显的增加乳腺癌细胞辐射后的生存分数,而敲低CHK1后可以明显降低乳腺癌细胞辐射后的生存分数,细胞免疫荧光实验发现敲低CHK1可以明显增加ΥH2AX位点,由此表明USP7和CHK1可以增加乳腺癌细胞的辐射抵抗能力。10.LINC02582通过结合USP7抑制CHK1的泛素化在乳腺癌细胞中过表达或抑制LINC02582然后检测CHK1蛋白水平,发现过表达LINC02582可以增加CHK1的蛋白水平,然而抑制LINC02582可以降低CHK1的蛋白水平。我们在乳腺癌细胞中过表达LINC02582,然后加入放线菌素抑制蛋白质的合成,检测CHK1蛋白的稳定性。实验结果表明,过表达LINC02582后可以增加CHK1蛋白的稳定性,抑制CHK1蛋白的降解。于此同时我们抑制LINC02582同时,加入蛋白酶抑制剂MG132,我们发现加入MG132可以增加CHK1蛋白水平。接着我们在过表达LINC02582后行泛素化实验检测CHK1的泛素化水平,实验结果表明过表达LINC02582可以抑制CHK1的泛素化,而在过表达LINC02582的同时再抑制USP7,可以阻断LINC02582对CHK1泛素化抑制作用。由此表明LINC02582可以结合USP7抑制CHK1的泛素化降解。11.USP7和CHK1介导LINC02582的辐射抵抗功能我们在MCF-7细胞中过表达LINC02582的同时敲除USP7,我们发现敲除USP7可以阻断LINC02582诱导的CHK1上调,而与此同时敲除USP7可以部分逆转LINC02582过表达引起的放疗抵抗。同时我们在MDA-MB-231细胞中抑制LINC02582的同时过表达USP7,我们发现过表达USP7可以逆转敲除LINC02582诱导的CHK1下调,且过表达USP7可以逆转敲除LINC02582引起的辐射增敏作用。在过表达LINC02582的乳腺癌细胞中抑制CHK1,而在敲除LINC02582的细胞中过表达CHK1,我们发现抑制CHK1可以逆转过表达LINC02582引起的辐射抵抗作用,而过表达CHK1可以阻断抑制LINC02582诱导的辐射增敏作用。综上所述研究发现USP7和CHK1在LINC02582对乳腺癌辐射敏感性的调节中起着关键作用。12.抑制USP7、CHK1可以阻断miR-200c的辐射增敏作用我们在过表达miR-200c的乳腺癌细胞中过表达LINC02582,发现过表达LINC02582可以阻断过表达miR-200c引起的CHK]下调和逆转miR-200c诱导的辐射增敏作用;同时在抑制miR-200c的乳腺癌细胞中过抑制LINC02582,发现过抑制LINC02582可以逆转抑制miR-200c引起的CHK1上调和抑制miR-200c引起的辐射抵抗作用。与此同时,抑制USP7可以阻断miR-200c敲除引起的CHK1上调和miR-200c敲除引起的辐射抵抗;而过表达USP7则可以解除miR-200c过表达引起的CHK1下调和miR-200c过表达引起的辐射增敏作用。过表达miR-200c的同时过表达CHK1,可以逆转miR-200c上调引起的辐射增敏作用,而抑制miR-200c的同时抑制CHK1,可以解除miR-200c抑制引起的辐射抵抗作用。由此表明miR-200c/LINC02582/USP7/CHK1功能轴,在乳腺癌辐射敏感性调节中具有重要作用。13.乳腺癌组织中的miR-200c与CHKI表达呈负相关实验中的共检测了136例乳腺癌组织标本,而且这136例病人在乳腺癌术后均接受了规范的放射治疗。我们发现乳腺癌组织中的miR-200c高表达的组织伴随CHK1的表达低,miR-200c的表达水平和LINC02582的表达水平呈负相关,Spearman相关分析发现,miR-200c与CHK1的表达呈负相关(R=-0.362P<0.01)。14.乳腺癌组织中的LINC02582及CHK1表达呈正相关在136例乳腺癌组织标中高表达LINC02582的组织伴随CHK1的表达高,Spearman相关分析发现,LINC02582与CHK1的表达呈正相关(R=0.454 P<0.01)。我们进一步分析发现LINC02582表达阳性的乳腺癌病人,放射治疗后的复发时间更早。LINC02582是乳腺癌放射治疗预后不良的标志物。结论:1.MiR-200c可以增加乳腺癌细胞的辐射敏感性2.MiR-200c可以抑制乳腺癌细胞上皮间质的转化3.MiR-200c的过表达可以诱导乳腺癌细胞中1ncRNA表达谱的改变4.LINC02582可以促进乳腺癌细胞的辐射抵抗5.LINC02582是miR-200c的功能靶基因6.乳腺癌中miR-200c的表达水平与LINC02582呈负相关7.LINC02582可以特异性结合USP7蛋白8.USP7可以调节CHK1水平促进乳腺癌细胞的辐射抵抗9.LINC02582可以结合USP7抑制CHK1蛋白的泛素化10.LINC02582通过USP7和CHK1促进辐射抵抗11.表达LINC02582可以阻断miR-200c的辐射增敏作用12.表达USP7可以阻断miR-200c的辐射增敏作用13.表达CHK1可以阻断miR-200c的辐射增敏作用14.乳腺癌中miR-200c的表达水平与CHK1呈负相关15.乳腺癌中LINC02582的水平表达与CHK1呈负相关16.LINC02582是乳腺癌放射治疗预后不良的标志物。