结直肠癌（Colorectal Cancer,CRC）是全球范围内常见消化系统恶性肿瘤,具有高发病率、高死亡率、易复发等特点。传统治疗方案包括手术切除、放疗和化疗等,但经传统方案治疗后,患者易复发、5年生存率低等问题仍未根本解决。因此,迫切需要一种新型有效的治疗策略,比如免疫治疗来增强CRC的疗效,提高患者生存率。近年来,结直肠癌干细胞（Colorectal Cancer Stem Cell,CCSC）学说,为认知结直肠癌的发生、发展和靶向治疗提供了新思路。CRC中有一群数目较少却具有较强自我更新、无限增殖、多向分化、耐药、迁移、侵袭等多项潜能的CCSC,是CRC发生发展、转移和治疗后复发的关键,又被称为CRC“种子”细胞。因此,近年来靶向CCSC治疗CRC成为研究关注点。目前广泛使用CD133作为分选CCSC标记分子之一。CCSC表面高表达一些优势抗原分子,使其相较于non-CCSC更具有免疫原性,制备的CCSC疫苗更易诱导免疫反应,靶向杀伤CCSC进而抑制肿瘤生长。黏蛋白分子mucin1（MUC1）参与CRC的增殖、耐药、迁移、侵袭和血管生成,并与患者临床预后密切相关;且MUC1分子胞外N端包括了一段数目可变的随机重复序列,含有TCR、BCR识别位点,是潜在的疫苗靶点。本课题研究选用CD133分子作为分选CCSC标记,应用免疫磁珠分选法从人源SW620细胞、鼠源CT26细胞中分选得到CD133+细胞,在鉴定其为CCSC后,应用反复冻融法制备成CCSC疫苗,对其诱导的抗肿瘤效应及机制进行探讨。目的:探讨富集优势抗原MUC1的CCSC疫苗抗CRC效应及机制,为临床CRC患者防治提供新的免疫防治策略。方法:1.分选与鉴定CCSC:采用免疫磁珠分选法,从人源SW620细胞系和鼠源CT26细胞系中分选得到CD133+细胞,通过增殖、克隆形成、迁移、侵袭、耐药、致瘤等实验,鉴定CD133+细胞是否具有CCSC生物学特性。2.筛选CCSC表面优势抗原:应用基于网络的基因组学分析和可视化应用程序R2（http://r2.amc.nl）平台,分析 Sveen 上传的数据库“Tumor Colon（Core-Exon）-333-rma-ketch-huex10p”包含的333例结肠癌样本中CD133表达水平、与CD133表达呈现正相关的基因和基因本体论,选择与CD133表达呈现正相关并且与CRC转移和患者不良预后密切相关的MUC1抗原进行研究。通过qRT-PCR和Western Blot检测MUC1的mRNA和蛋白表达,构建敲低MUC1的SW620稳定感染细胞系（shMUC1 SW620）,敲低、过表达MUC1的CT26稳定感染细胞系（MUC1敲低CT26,MUC1过表达CT26）,鉴定MUC1的mRNA和蛋白表达水平,检测调控MUC1表达对CRC细胞的克隆形成、迁移、侵袭能力的影响。3.人源CRC细胞系SW620 CCSC疫苗效应及机制研究:从shMUC1 SW620细胞和SW620细胞中分选得到shMUC1 CCSC和CCSC,反复冻融法（-80℃ 30min,37℃ 30min,重复三次）制备shMUC1 CCSC疫苗、CCSC疫苗、SW620细胞疫苗和non-CCSC疫苗。用2×105不同细胞疫苗免疫BALB/c裸鼠三次,每次间隔10天,末次免疫10天后用2×106野生型SW620细胞攻击免疫鼠。检测并记录小鼠出瘤时间、肿瘤生长、无瘤鼠比例。末次免疫10天后取免疫鼠血液标本检测肝、肾、心功能和全血细胞计数等;取小鼠心、肺、肝、肾、肠等组织做苏木素伊红染色。2×106野生型SW620细胞攻击免疫鼠40天后处死小鼠,取免疫鼠肿瘤组织分离肿瘤细胞与肿瘤浸润免疫细胞,分别检测CD133+细胞比例、醛脱氢酶（Aldehyde dehydrogenase,ALDH）+细胞比例、肿瘤浸润性CD3-CD49b+NK细胞比例、分泌IFN-γ的肿瘤浸润NK细胞数、肿瘤浸润免疫细胞表达穿孔素、颗粒酶B水平。取小鼠脾脏细胞分选得到CD3-CD49b+NK细胞,检测NK细胞毒活性、抗体依赖的细胞介导的细胞毒活性（Antibody Dependent Cell mediated Cytotoxicity,ADCC）。取小鼠脾脏细胞检测 CD19+B 细胞和B220+CD38+CD80+记忆B细胞比例。取小鼠血清检测细胞因子IFN-γ、抗MUC1 IgG抗体水平、补体依赖的细胞毒活性（Complement Dependent Cytotoxicity,CDC）。4.鼠源CRC细胞系CT26 CCSC疫苗效应及机制研究:（1）分别从MUC1敲低CT26细胞、MUC1过表达CT26细胞和CT26细胞中分选得到MUC1敲低CCSC、MUC1过表达CCSC和CCSC,将其分别反复冻融后,制备成MUC1敲低CCSC疫苗、MUC1过表达CCSC疫苗、CCSC疫苗、CT26细胞疫苗和non-CCSC疫苗。用2×105不同细胞疫苗免疫BALB/c小鼠三次,每次间隔10天,末次免疫10天后用2×106野生型CT26细胞攻击免疫鼠。检测并记录小鼠出瘤时间、肿瘤生长、无瘤鼠比例。2×106野生型CT26细胞攻击免疫鼠40天后处死小鼠,取小鼠脾细胞检测CD16+NKG2D+NKp46+活化NK细胞比例、CD4+T细胞和CD8+T细胞比例、B220+CD38+CD80+记忆B细胞比例、检测NK细胞毒活性、脾细胞毒活性、ADCC活性、CDC活性、CD8+T细胞毒活性和分泌IFN-γ的脾CD8+T细胞数。检测肿瘤浸润免疫细胞表达穿孔素、颗粒酶B水平。取小鼠血清检测细胞因子IFN-γ、TGF-β1和抗MUC1 IgG抗体水平。取免疫鼠瘤组织检测CD133+细胞、ALDH+细胞、MAC1+GR1+MDSC和CD4+CD25+Treg细胞比例。检测MUC1敲低/过表达CCSC和CCSC疫苗免疫鼠肿瘤组织中TGF-β1mRNA表达水平。（2）应用抗MUC1抗体封闭CCSC疫苗MUC1抗原表位,反复冻融法制备中和抗体CCSC疫苗,同时设置CCSC疫苗、non-CCSC疫苗、PBS组和中和抗体CCSC疫苗IgG对照组,分析其抗肿瘤效应。结果:1.免疫磁珠分选得到的CD133+SW620和CD133+CT26细胞亚群在93%以上。与non-CD133+细胞相比,CD133+细胞具有更强的克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力、耐药能力和在小鼠体内形成肿瘤的能力,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.结肠癌333例样本中均表达CD133分子,且平均表达评分为1476.2。有10088个基因表达与CD133呈现正相关,9399个基因表达与CD133呈现负相关。部分正相关基因参与CRC细胞间黏附、蛋白糖基化等过程,与CRC细胞转移密切相关。其中,黏蛋白家族成员之一 MUC1,在CD133+CCSC中的mRNA和蛋白表达水平显著高于non-CD133+CCSC,差异具有统计学意义（P<0.05）。成功构建并鉴定shMUC1 SW620细胞系、MUC1敲低CT26细胞系和MUC1过表达CT26细胞系。过表达MUC1增强了 CCSC克隆形成能力、迁移能力和侵袭能力,而敲低MUC1则减弱了 CCSC的克隆形成能力、迁移能力和侵袭能力。3.人源CRC细胞系SW620 CCSC疫苗免疫鼠与肿瘤攻击实验结果显示,与non-CCSC疫苗组、SW620细胞疫苗组和shMUC1CCSC疫苗组相比,CCSC疫苗组小鼠肿瘤生长受到抑制,出瘤时间较晚且肿瘤体积较小,抗肿瘤效应最好;CCSC疫苗免疫鼠瘤组织CD133+CCSC、ALDH+细胞比例较低、肿瘤浸润性CD3-CD49b+NK细胞比例较高;免疫鼠NK细胞毒活性、ADCC活性、CDC活性、CD19+B细胞比例和B220+CD38+CD80+记忆B细胞比例较高;免疫鼠血清IFN-γ和抗MUC1 IgG抗体水平较高;免疫鼠肿瘤浸润免疫细胞分泌穿孔素、颗粒酶B水平较高,与其它各疫苗组实验结果相比,差异具有统计学意义（P<0.05）。各疫苗免疫组小鼠血样本的肝、肾、心功能检测结果分别显示血清谷丙转氨酶,谷草转氨酶、血尿素氮、肌酐、心肌肌钙蛋白Ⅰ、肌酸激酶同工酶等指标均在正常范围内,血液中白细胞、血小板等指标也均在正常范围内,免疫鼠心、肺、肝、肾、肠等组织苏木素伊红染色结果显示,不同疫苗对小鼠组织没有细胞毒性。4.鼠源CRC细胞系CT26 CCSC疫苗免疫鼠与肿瘤攻击实验结果显示,与non-CCSC疫苗组和CT26细胞疫苗组相比,CCSC疫苗组小鼠出瘤时间较晚,肿瘤生长较慢,肿瘤体积较小。脾脏来源的CD16+NKG2D+NKp46+NK细胞比例、CD8+T细胞比例、CD45R+CD19+B细胞比例和B220+CD38+CD80+记忆B细胞比例较高。NK细胞毒活性、脾细胞毒活性、ADCC活性、CDC活性、CD8+T细胞毒活性和CD8+T细胞分泌IFN-γ能力较强;免疫鼠血清IFN-γ和抗MUC1 IgG抗体水平较高,而TGF-β1水平较低;免疫鼠肿瘤浸润免疫细胞分泌穿孔素和颗粒酶B水平较高。CCSC疫苗免疫鼠肿瘤组织CD133+CCSC比例、ALDH+细胞比例、CD4+CD25+Treg比例和MAC1+GR1+MDSC 比例较低,与其它各疫苗组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）。相对于其它各疫苗组,敲低MUC1减弱了 CCSC疫苗抑制肿瘤生长作用,而过表达MUC1则增强了 CCSC疫苗抑制肿瘤生长作用,差异具有统计学意义（P<0.05）。应用抗MUC1抗体封闭CCSC疫苗MUC1抗原表位,CCSC疫苗的抗肿瘤效应随之减弱,与对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.MUC1在CD133+CCSC中高表达,与CD133+CCSC疫苗诱导免疫鼠的免疫反应呈正相关,是CD133+CCSC疫苗的优势靶抗原。2.富集MUC1优势抗原的CD133+CCSC疫苗,能诱导免疫鼠靶向杀灭CCSC,发挥抗CRC效应,抑制CRC生长。敲低MUC1表达,减弱了 CCSC疫苗的抗CRC效应,而上调MUC1表达,可以增强CCSC疫苗的抗CRC效应。3.本研究制备的CD133+CCSC疫苗能有效激发免疫鼠产生抗CRC效应,这为临床上应用CD133+CCSC疫苗免疫防治CRC提供了科学的实验依据。