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Twist基因影响结肠癌侵袭转移能力的研究Twist基因在恶性肿瘤细胞上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)中发挥重要作用。在这项研究中,我们通过SW480.HCT116. HT29结肠癌细胞系和裸鼠结肠癌肝转移模型,研究Twist基因和EMT相关分子Vimentin和E-cadherin在体外和体内的表达。第一部分Twist基因影响结肠癌细胞系侵袭转移能力的体外实验目的：探讨Twist基因在调控SW480.HCT116和HT29结肠癌细胞系发生EMT中的作用机制,进而明确其对恶性肿瘤侵袭转移能力的影响。方法：培养人结肠癌细胞系SW480、HCT116和HT29,应用Real time-PCR和Western blot法检测三种细胞系Twist分子的mRNA转录和蛋白表达水平。提取、纯化并重组质粒,包括表达Twist基因pTracer-CMV/BSD-Twist和空质粒pTracer-CMV/BSD,抑制Twist基因表达的pGenesil1.2-Twist-shRNA和空质粒pGenesil1.2-shRNA.通过阳离子脂质体介导分别转染至3个结肠癌细胞系,每个细胞系分5组：(1)上调实验组：转染质粒pTracer-CMV/BSD-Twist(2)上调阴性对照组：转染空质粒pTracer-CMV/BSD；(3)下调实验组：转染质粒pGenesil1.2-Twist-shRNA；(4)下调阴性对照组：转染空质粒pGenesil1.2-shRNA；(5)空白对照组：未转染细胞。使用流式细胞技术检测细胞转染率,应用Real time-PCR和Western blot检测结肠癌细胞Twist,E-cadherin和Vimentin分子mRNA转录及蛋白表达水平,采用MTT法检测转染细胞的生长增殖能力,使用Transwell迁移实验和侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭能力。结果：1.在三个人结肠癌细胞系SW480.HCT116和HT29中,Twist分子mRNA转录和蛋白表达水平由高到低依次为HCT116→SW480→Ht29,其差异具有统计学意义。2.成功提取、纯化和重组pTracer-CMV/BSD,pTracer-CMV/BSD-Twist, pGenesil1.2shRNA和pGenesil1.2-Twist-shRNA质粒。3.将上述质粒转染3个细胞系48hrs后,倒置荧光显微镜下可见质粒转染组中细胞表达绿色荧光蛋白。4.流式细胞仪检测pTracer-CMV/BSD-Twist质粒转染率在SW480、HCT116和HT29分别为21.6%、22.3%and22.7%,pGenesil1.2-Twist-shRNA质粒转染率为21.2%、23.4%和30.3%。5. pTracer-CMV/BSD-Twist质粒转染结肠癌细胞系,SW480、HCT116和HT29均较转染前高表达Twist分子(P<0.05),Vimentin分子mRNA转录及蛋白表达水平升高(P<0.05),而E-cadherin分子mRNA转录及蛋白表达水平降低(P<0.05),质粒转染的各细胞系间比较其差异无显著性(P>0.05)。相关性分析显示,Twist与Vimentin的mRNA转录和蛋白表达水平呈正相关(P<0.01),而与E-cadherin呈负相关(P<0.01).6. pGenesil1.2-Twist-shRNA质粒转染SW480、HCT116和HT29后,HCT116细胞系Twist和Vimentin的mRNA转录及蛋白质表达水平较转染前显著降低(P<0.05),E-cadherin分子转录和表达水平在转染前后的差异无统计学意义(P>0.05)。SW480和HT29细胞系在pGenesil1.2-Twist-shRNA质粒转染前后各指标均无显著性差异(P>0.05)。相关性分析显示,只有HCT116细胞系Twist和Vimentin的mRNA转录及蛋白质表达水平呈正相关(P<0.01)。7.重组质粒转染后对三种细胞系的增殖和活力没有影响。8.pGenesil1.2-Twist-shRNA质粒转染IICT116细胞系后其迁移和侵袭能力明显受到抑制(P<0.01)。结论：1.在人结肠癌细胞系SW480, HCT116和HT29中,HCT116的Twist基因表达最高。2.上调上述3个细胞系Twist基因表达,可以促使Vimentin分子高表达和E-cadherin分子低表达增强肿瘤细胞的转移能力,促进了EMT分子事件的发生。3.干扰Twist基因可以有效地沉默HCT116细胞系Twist基因的表达,降低Vimentin的表达,逆转上皮间质转化,促进间质上皮转化,有效的抑制了结肠癌细胞的侵袭迁移。第二部分Twist基因影响结肠癌侵袭转移的体内实验目的：研究Twist基因和EMT相关指标在裸鼠结肠癌肝转移模型中的表达。方法：使用重组质粒pTracer-CMV/BSD-Twist、pGenesil1.2-Twist-shRNA和阴性对照转染SW480,HCT116和HT29,采用脾脏注射法建立裸鼠肝转移模型,注射30天后取肝脏和脾脏标本,应用Real time-PCR和免疫组化法检测肝脏和脾脏Twist和Vimentin的mRNA转录和蛋白表达。结果：成功建立裸鼠结肠癌肝转移模型,3个细胞系无论是否进行质粒转染,其模型的肝脏组织Twist和Vimentin的mRNA转录水平明显高于脾脏(P<0.05)。注射pTracer-CMV/BSD-Twist质粒转染细胞系后,与注入未转染的细胞系比较,肝脏和脾脏具有更高的Twist和Vimentin分子mRNA转录水平(P<0.05)。注射pGenesill.2-Twist-shRNA质粒转染细胞系后,肝脏和脾脏Twist和Vimentin分子mRNA转录水平较注射质粒pTracer-CMV/BSD-Twist均显著降低(P<0.05),但与注入未转染的细胞系比较只有HCT116组出现Twist和Vimentin的mRNA转录水平显著下降(P<0.05)。结论：在HCT116细胞系,RNA干扰Twist基因能够有效沉默该基因在体内表达,从而抑制裸鼠结肠癌模型侵袭转移潜能能力。