论文部分内容阅读
定量蛋白质组学是目前蛋白质组学研究的热点和难点之一。定量蛋白质组学可以分为相对定量和绝对定量，其中绝对定量方法是定量蛋白质组学发展的主要瓶颈。定量试剂盒价格昂贵，蛋白质组学的高通量特点，内标肽段制备困难，实际样本酶解不完全等问题制约着蛋白质绝对定量方法的发展。本论文针对绝对定量蛋白质组学存在的问题，首先针对传统溶液酶解存在的酶解时间较长、酶自切物干扰、蛋白酶不能重复使用以及实际样本酶解不完全等问题，制备了一种新型的原子转移自由基聚合修饰银丝固定化酶反应器。另外还发展了金属标记结合选择离子监测质谱技术(SIM)的绝对定量新方法，并应用于腾冲嗜热菌中蛋白质的绝对定量分析。本论文由三章组成。第一章概述了定量蛋白质组学的研究现状、化学标记结合质谱方法在定量蛋白质组学中的应用、金属标记的研究现状和发展前景、酶解对定量蛋白质组学的影响等内容，最后结合当前研究背景提出了本课题的研究内容。第二章制备了一种以银丝为载体的新型的固定化酶反应器。采用标准蛋白质和质谱考察了银丝固定化酶反应器的酶解效率、重复性和回收率。结果表明：绒毛状聚合物修饰的银丝固定化酶反应器的酶解效率较高，酶解标准蛋白BSA20min后，肽段的氨基酸序列覆盖率可达93%，好于传统溶液酶切方法酶切16h得到的79%的覆盖率；使用该固定化酶反应器在一个月内8次酶解BSA所得的氨基酸序列覆盖率在89%到97%之间，平均覆盖率为94%，显示出其具有良好的稳定性。另外MYO的回收率实验结果表明该固定化酶的回收率为87.67%。最后，银丝固定化酶反应器酶解腾冲嗜热菌全蛋白20min所鉴定到的序列覆盖率和鉴定的蛋白数量与同样条件下溶液酶解16小时的结果接近，而零漏切位点肽段的比例更高，证明该固定化酶对实际样本的酶解更加完全。第三章建立了金属标记结合选择性离子监测质谱（SIM）技术的蛋白质绝对定量新方法。实验考察了金属标记效率、金属标记的稳定性、标记后肽段的色谱保留行为、质谱行为、线性范围和准确度，实验结果表明金属标记具有标记效率高，稳定性好，色谱保留行为一致等优点；使用该方法时，两条肽段在1fmol-500fmol的物质的量范围内的R2值大于0.99，具有良好的线性关系；两条肽段的最低定量限都达到1fmol。另外，该方法具有较高的准确度。综合以上结果表明该定量方法可以用于生物样本中的蛋白质的绝对定量分析。