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研究目的：2型糖尿病作为目前人群中最为主要的糖尿病类型,其大血管并发症尤其是以动脉粥样硬化为主要表现的心脑血管系统疾病是导致患者高致残率、高致死率的主要原因之一,但其发病机制尚未完全阐明。根据针对2型糖尿病及合并相应大血管并发症患者的MeDIP-DNA甲基化基因芯片结果,本研究拟通过ROI分析、GO和Pathway富集分析方法对其进行统计学计算,筛选出组间具有统计学差异的基因,并寻找其在大血管并发症中可能参与的生物学过程及相关信号通路,为预测2型糖尿病大血管并发症提供早期DNA甲基化标志物。研究方法：分别选取2型糖尿病无并发症患者、2型糖尿病合并冠心病患者以及2型糖尿病合并脑卒中患者各3例,通过对其外周血样本单个核细胞基因组DNA进行MeDIP法甲基化芯片检测,得到各样本基因启动子区和CpG岛不同探针的原始数据及富集峰值。应用ROI分析,通过计算芯片各探针覆盖区域的平均log2-ratio值,对各样本及不同分组之间富集峰值的甲基化差异进行统计学检验,筛选出2型糖尿病大血管并发症组间具有统计学差异(p<0.05)的基因启动子区CpG岛。对ROI分析所得的甲基化差异启动子区CpG岛,运用Fisher精确检验来判断其在蛋白生物学过程、细胞组分、分子学功能等方面及信号通路之间是否具有统计学差异(p<0.05),即GO分析,并应用DAVID Bioinformatics Resources6.7和KEGG Pathway Database筛选与2型糖尿病大血管并发症的相关信号通路。研究结果：ROI统计学分析芯片结果发现2型糖尿病无并发症组与合并冠心病组间共有139个基因启动子区CpG岛具有甲基化差异；2型糖尿病无并发症组与合并脑卒中组间共有381个基因启动子区CpG岛具有甲基化差异。其中两组间共有相同的DNA甲基化差异性基因59个。通过相关通路对比发现,以上差异性基因位点较集中于黏着斑通路、MAPK信号通路、胰岛素信号通路等与2型糖尿病发病机制有密切关联的信号通路。研究结论：通过对MeDIP-DNA甲基化基因芯片原始结果的统计学分析,发现2型糖尿病大血管并发症患者可能存在DNA甲基化改变的59个基因位点,并参与某些与2型糖尿病发病机制密切相关的信号转导通路。研究目的：验证血管平滑肌细胞增殖相关基因AKT1、ELK1在2型糖尿病心脑血管并发症患者中的甲基化状态、mRNA及蛋白表达水平。研究方法：收集8例健康成人外周血样本作为对照组,另收集2型糖尿病无并发症、2型糖尿病伴冠心病、2型糖尿病伴脑卒中各8例患者外周血样本作为研究对象,应用甲基化特异性PCR方法(MSP)检测AKTl、ELK1基因在各标本中的甲基化水平；采用实时定量PCR方法检测共32例外周血样本中AKTl、ELK1基因的mRNA表达；采用酶联免疫吸附法(Elisa)检测32例样本血清中Akt1、Elk-1蛋白的表达水平。研究结果：1.甲基化特异性PCR检测AKTl表明,在8例正常对照组中,共有6例标本表现为部分甲基化；其余2例仅扩增出未甲基化条带,甲基化比例为75%；8例2型糖尿病无并发症组中,共有4例标本表现为部分甲基化,其余4例表现为未甲基化状态,甲基化比例为50%；8例2型糖尿病合并冠心病组中,仅有1例标本表现为部分甲基化,其余7例均为未甲基化状态,甲基化比例仅为12.5%；8例2型糖尿病合并脑卒中标本均表现为未甲基化状态,甲基化比例为0。实时定量PCR检测AKT1mRNA表达水平结果发现,2型糖尿病合并冠心病组、合并卒中组的AKT1mRNA表达水平与2型糖尿病无并发症组相比明显升高(p<0.001)o Elisa检测血清Akt1蛋白水平结果与实时定量PCR相一致。2.甲基化特异性PCR检测ELK1表明,在8例正常对照组中,共有6例标本表现为部分甲基化；其余2例仅扩增出未甲基化条带,甲基化比例为75%；8例2型糖尿病无并发症组中,共有5例标本表现为部分甲基化,其余3例表现为未甲基化状态,甲基化比例为62.5%；8例2型糖尿病合并冠心病组中,仅有3例标本表现为部分甲基化,其余5例均为未甲基化状态,甲基化比例仅为37.5%；8例2型糖尿病合并卒中组中仅有1例标本表现为部分甲基化；其余7例均为未甲基化状态,甲基化比例仅为12.5%；实时定量PCR检测ELK1mRNA表达水平结果发现,2型糖尿病合并冠心病组、合并卒中组的AKTl mRNA表达水平与2型糖尿病无并发症组相比明显升高(p<0.001)。然而Elisa检测结果表明,各组之间Elk-1蛋白浓度比较并未见明显统计学差异(p＜0.05)。研究结论：1.AKT1基因启动子区CpG岛在2型糖尿病无并发症组中呈高甲基化状态,而在2型糖尿病大血管并发症组中呈低(或未)甲基化状态,并导致相应mRNA转录及蛋白表达水平发生变化,表明AKT1基因启动子区CpG岛去甲基化改变参与了2型糖尿病心脑血管并发症的发生。2.在2型糖尿病无并发症组中ELK1基因启动子区CpG岛呈现出高甲基化状态,而在2型糖尿病大血管并发症组中呈低(或未)甲基化状态,并出现相应mRNA转录水平改变,但其与2型糖尿病大血管并发症发病机制的关联仍需进一步研究。通过上述研究,本课题可得出以下结论：1.DNA甲基化标记物具备作为2型糖尿病患者大血管并发症预测指标的可能性；2.血管平滑肌细胞增殖相关基因AKT1、ELK1启动子区CpG岛去甲基化状态与2型糖尿病冠心病、脑卒中等大血管并发症的发生存在相互联系。