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研究背景与目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,据资料统计,发病率占全身各种恶性肿瘤的7%-10%,仅次于宫颈癌,但近年来有超过子宫颈癌的倾向,并呈逐年上升趋势。乳腺周围淋巴管网丰富,其主要转移途径为局部扩散、淋巴转移和血运转移。以往认为血运转移多发生在晚期,这一概念已被否定。研究发现有些早期乳腺癌已有血运转移。癌细胞可经淋巴途径进入静脉,也可直接侵入血循环而致远处转移。最常见的远处转移依次为肺、骨、肝。是否转移在很大程度上影响着患者术后的生存质量,因此,探讨乳腺癌通过血运转移的机制,寻找有效的分子治疗靶标,抑制乳腺癌通过血运转移,成为目前国内外分子肿瘤学研究热点。肿瘤的生长高度依赖于它的血管供应。然而,肿瘤生长需要的养分和氧气往往超过现有脉管系统为它供给的能力。因此,肿瘤的持续生长需要新的血管。这种实体肿瘤诱导的血管生成包括两个相辅相成的过程：发芽血管生成和血管新生。发芽血管生成是局部反应,涉及现有的血管。血管新生,是通过动员和募集骨髓来源细胞形成新的血管。实验室前期研究工作(激光捕获显微切割技术和生物芯片分析)获得乳腺癌组织与正常乳腺组织之间淋巴内皮细胞差异表达的基因Sema4C,并在多种癌组织和对应正常组织中检测Sema4C的表达。本研究旨在探讨Sema4C在多种体外肿瘤细胞系和体内乳腺癌组织中的表达情况,及其在肿瘤生长和肿瘤血管生成中的作用。基于Sema4C在乳腺癌组织中表达异于正常乳腺组织,从而影响乳腺癌微环境而促进肿瘤血管新生和肿瘤生长,促进肿瘤血运转移,因此,通过药物或者遗传手段控制Sema4C功能或其调节通路,将是一个振奋人心的抗乳腺癌生长和血运转移的分子治疗靶点。方法收集27株肿瘤细胞系及2株正常永生化细胞系,应用Trizol法抽提总mRNA,荧光实时定量PCR法检测Sema4C的表达；免疫组化EnvisionTM二步法及半定量分析方法检测乳腺癌150例,乳腺增生组织10例中Sema4C的表达,并进行相关临床病理因素分析；采用慢病毒基因干预技术,转染MDA-MB-231细胞,流式筛选后获得带有红色荧光(RFP)稳定封闭SEMA4C基因的细胞株和对照细胞株,检测这两株细胞在裸鼠体内的生长情况；应用MTT法检测两株细胞的生长情况；应用PI染色流式细胞术检测封闭SEMA4C后细胞周期的变化；收集两株细胞上清,应用Transwell体外运动实验检测肿瘤上清对血管内皮细胞和巨噬细胞的趋化；应用三维培养试验观察肿瘤细胞上清对血管内皮细胞形成管样结构能力的改变；将两株细胞上清经RayBiotech细胞因子抗体芯片筛选调控血管生成的细胞因子。结果1. Sema4C在29株细胞系中普遍表达,但在肿瘤细胞中的表达普遍高于正常永生化细胞；在上皮性来源的肿瘤细胞株中,侵袭转移能力强的细胞中Sema4C的表达高于侵袭转移能力弱的细胞。2.免疫组化结果提示乳腺癌中Sema4C的表达高于正常乳腺和乳腺良性病变；并且与肿瘤血管密度高度相关。3.实时定量PCR和Western blot结果显示,慢病毒转染的细胞株封闭SEMA4C基因的效果稳定,动物体内试验发现,封闭掉SEMA4C后的瘤体生长慢,体积小,瘤周和瘤内血管密度低,巨噬细胞减少,远处转移少。4.MTT试验结果表明封闭SEMA4C后的MDA-MB-231细胞较对照生长速度明显减慢,光学显微镜下发下细胞形态发生变化,细胞变的肥大、核大、细胞质变少并有空泡形成；PI染色流式细胞术试验结果提示封闭SEMA4C后的细胞出现G2/M期细胞阻滞,Annexin V-FITC/PI-PE细胞凋亡染色结果无统计学差异,但β-半乳糖苷酶染色提示细胞发生衰老。5.利用人淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞,经GM-CSF和IL-4刺激后转化为巨噬细胞,Transwell体外实验提示封闭SEMA4C后的MDA-MB-231细胞上清趋化血管内皮细胞HUVEC和巨噬细胞能力减弱,三维培养试验证明封闭SEMA4C后的231细胞上清减弱了HUVEC的成管能力。6.收集封闭SEMA4C后的MDA-MB-231细胞和对照MDA-MB-231上清经RayBiotech细胞因子抗体芯片分析发现,封闭SEMA4C后的MDA-MB-231细胞上清中的Angiogenin和CSF-1分泌减少,差异具有统计学意义。结论在细胞水平,Sema4C在肿瘤细胞系中表达普遍高于正常细胞系,特别是在乳腺癌中它的表达水平与肿瘤的转移潜能成正比；在组织水平,Sema4C在乳腺癌中的表达高于正常乳腺组织和乳腺良性病变,并且与肿瘤血管密度高度相关。试验证实,Sema4C通过调控乳腺癌肿瘤细胞自身生长和肿瘤微环境中Angiogenin和CSF-1的表达来调控乳腺癌生长、血管生成、巨噬细胞募集和远处转移。综上所述,首次发现Sema4C在乳腺癌组织中高表达与肿瘤血管密度高度相关,并且抵抗乳腺癌细胞衰老,促进乳腺癌微环境中Angiogenin和CSF-1分泌来促进肿瘤血管新生和血运转移。因此,Sema4C是一个振奋人心的抗乳腺癌生长和血运转移的分子靶点。