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环境雌激素作为一类外源性化学物质，能够干扰人体与动物体正常内分泌机能。塑料制品及农药的大量使用、工业生产、垃圾焚烧等活动会造成环境雌激素的污染。环境雌激素可进入土壤、水流、空气中，通过一系列活动最终进入人的体内，干扰人的生殖系统、内分泌系统、神经系统、免疫系统，并且有致畸致癌作用。因此建立适合环境雌激素的检测方法至关重要。
卵黄蛋白原（Vitellogenin，Vtg）产生于鱼的肝脏，后运输到卵巢发挥作用。由于卵黄蛋白原的产生受到雌激素调控，所以卵黄蛋白原只存在于雌鱼体内，而在未受到环境雌激素污染的雄鱼及幼鱼体内并不存在。因此Vtg可作为一种环境雌激素指示物反应环境受到雌激素污染的程度。
本文利用未受到环境雌激素污染的雄性鲫鱼建立了基于雄性鲫鱼原代肝细胞酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测9种雌激素的方法，并将该方法用于猪肉不同加工方式产生的未知雌激素的筛查。
本文实验包括以下三部分：
1、雄性鲫鱼原代肝细胞培养模型的建立
首先将从市场购得的雄性鲫鱼在实验室培养7d再用于后续实验。将雄性鲫鱼肝脏取出后，优化雄性鲫鱼原代肝细胞培养条件：原代肝细胞胰酶消化浓度、胰酶消化时间、红细胞去除方式及原代细胞培养时间。雄性鲫鱼原代肝细胞最适胰酶消化浓度为0.25%，消化时间为15min。红细胞裂解法来去除原代肝细胞中的红细胞效果较好。在细胞培养基为M199完全培养基，细胞培养温度为28℃，CO2浓度为5%左右的条件下，在原代肝细胞培养的0-72h内进行毒理学实验较为合适。
2、ELISA法检测17β-雌二醇等9种雌激素对雄性鲫鱼原代肝细胞卵黄蛋白原的诱导作用
本部分利用浓度为1×10-6mol/L17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）染毒雄性鲫鱼原代肝细胞4d，ELISA法检测雄性鲫鱼原代肝细胞Vtg的表达量，在染毒第三天时Vtg表达量最高。以不同浓度的17β-雌二醇染毒雄性鲫鱼原代肝细胞，ELISA法检测染毒三天后雄性鲫鱼原代肝细胞Vtg的表达量，得到不同浓度的17β-雌二醇与Vtg表达量之间的剂量效应关系。同时，探究不同浓度的17α-雌二醇（17α-estradiol，EE2）、己烷雌酚（Hexestrol，HEX）、雌酮（Estrone，E1）、木黄酮（Genistein）、2,2-二（对羟基苯基）-1,1,1-三氯乙烷（2,2-bis(p-hydroxyphenyl)-1,1,1-trichloroethane，HPTE）、己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES）、双酚A（Bisphenol A，BPA）和双酚B（Bisphenol B，BPB）对雄性鲫鱼原代肝细胞Vtg诱导作用。通过实验发现除雌酮外其余7种雌激素在一定的浓度范围内与Vtg表达量之间均存在良好的剂量效应关系。通过以上实验建立了基于雄性鲫鱼原代肝细胞酶联免疫法检测9种雌激素的方法。
3、猪肉不同加工方式产生的未知雌激素的筛查
本部分将建立的基于鲫鱼原代肝细胞酶联免疫法检测9种雌激素的方法应用于猪肉不同加工方式产生的未知雌激素的筛查。首先利用添加17β-雌二醇的未加工新鲜猪肉优化雌激素水解方式、提取方式、提取溶剂。通过实验发现采用未水解、乙腈、涡旋方式处理未加工新鲜猪肉得到的提取物诱导雄性鲫鱼原代肝细胞Vtg表达量最高。采用未水解、乙腈、涡旋提取的方式对煎制、煮制、烤制猪肉中未知雌激素进行提取，发现烤制方式得到的猪肉提取物诱导雄性鲫鱼原代肝细胞Vtg的表达量高于其余2种加工方式。以上所有样品在加入原代细胞培养液之前都经过雌激素固相萃取柱富集纯化。将未水解、乙腈、涡旋处理的烤制猪肉样品进行薄层层析（Thin-Layer chromatography，TLC）分离成分，二氯甲烷与甲醇作为薄层层析展开剂比例为2：1时效果最好。薄层层析得到的各组分染毒雄性鲫鱼原代肝细胞，将诱导雄性鲫鱼原代肝细胞卵黄蛋白原最多的组分进行质谱分析，确定其含有的雌激素种类。通过质谱分子量为279.0470物质可能为对苯二甲酸二丁酯。邻苯二甲酸二丁酯已经被证明具有雌激素效应。
本文基于雄性鲫鱼原代肝细胞建立了一种检测环境雌激素的方法，并将其应用于猪肉不同加工方式产生的未知雌激素的筛查。本文可为未来雌激素的检测及筛查提供一种参考，但进一步应用需待后续研究支持。
卵黄蛋白原（Vitellogenin，Vtg）产生于鱼的肝脏，后运输到卵巢发挥作用。由于卵黄蛋白原的产生受到雌激素调控，所以卵黄蛋白原只存在于雌鱼体内，而在未受到环境雌激素污染的雄鱼及幼鱼体内并不存在。因此Vtg可作为一种环境雌激素指示物反应环境受到雌激素污染的程度。
本文利用未受到环境雌激素污染的雄性鲫鱼建立了基于雄性鲫鱼原代肝细胞酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测9种雌激素的方法，并将该方法用于猪肉不同加工方式产生的未知雌激素的筛查。
本文实验包括以下三部分：
1、雄性鲫鱼原代肝细胞培养模型的建立
首先将从市场购得的雄性鲫鱼在实验室培养7d再用于后续实验。将雄性鲫鱼肝脏取出后，优化雄性鲫鱼原代肝细胞培养条件：原代肝细胞胰酶消化浓度、胰酶消化时间、红细胞去除方式及原代细胞培养时间。雄性鲫鱼原代肝细胞最适胰酶消化浓度为0.25%，消化时间为15min。红细胞裂解法来去除原代肝细胞中的红细胞效果较好。在细胞培养基为M199完全培养基，细胞培养温度为28℃，CO2浓度为5%左右的条件下，在原代肝细胞培养的0-72h内进行毒理学实验较为合适。
2、ELISA法检测17β-雌二醇等9种雌激素对雄性鲫鱼原代肝细胞卵黄蛋白原的诱导作用
本部分利用浓度为1×10-6mol/L17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）染毒雄性鲫鱼原代肝细胞4d，ELISA法检测雄性鲫鱼原代肝细胞Vtg的表达量，在染毒第三天时Vtg表达量最高。以不同浓度的17β-雌二醇染毒雄性鲫鱼原代肝细胞，ELISA法检测染毒三天后雄性鲫鱼原代肝细胞Vtg的表达量，得到不同浓度的17β-雌二醇与Vtg表达量之间的剂量效应关系。同时，探究不同浓度的17α-雌二醇（17α-estradiol，EE2）、己烷雌酚（Hexestrol，HEX）、雌酮（Estrone，E1）、木黄酮（Genistein）、2,2-二（对羟基苯基）-1,1,1-三氯乙烷（2,2-bis(p-hydroxyphenyl)-1,1,1-trichloroethane，HPTE）、己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES）、双酚A（Bisphenol A，BPA）和双酚B（Bisphenol B，BPB）对雄性鲫鱼原代肝细胞Vtg诱导作用。通过实验发现除雌酮外其余7种雌激素在一定的浓度范围内与Vtg表达量之间均存在良好的剂量效应关系。通过以上实验建立了基于雄性鲫鱼原代肝细胞酶联免疫法检测9种雌激素的方法。
3、猪肉不同加工方式产生的未知雌激素的筛查
本部分将建立的基于鲫鱼原代肝细胞酶联免疫法检测9种雌激素的方法应用于猪肉不同加工方式产生的未知雌激素的筛查。首先利用添加17β-雌二醇的未加工新鲜猪肉优化雌激素水解方式、提取方式、提取溶剂。通过实验发现采用未水解、乙腈、涡旋方式处理未加工新鲜猪肉得到的提取物诱导雄性鲫鱼原代肝细胞Vtg表达量最高。采用未水解、乙腈、涡旋提取的方式对煎制、煮制、烤制猪肉中未知雌激素进行提取，发现烤制方式得到的猪肉提取物诱导雄性鲫鱼原代肝细胞Vtg的表达量高于其余2种加工方式。以上所有样品在加入原代细胞培养液之前都经过雌激素固相萃取柱富集纯化。将未水解、乙腈、涡旋处理的烤制猪肉样品进行薄层层析（Thin-Layer chromatography，TLC）分离成分，二氯甲烷与甲醇作为薄层层析展开剂比例为2：1时效果最好。薄层层析得到的各组分染毒雄性鲫鱼原代肝细胞，将诱导雄性鲫鱼原代肝细胞卵黄蛋白原最多的组分进行质谱分析，确定其含有的雌激素种类。通过质谱分子量为279.0470物质可能为对苯二甲酸二丁酯。邻苯二甲酸二丁酯已经被证明具有雌激素效应。
本文基于雄性鲫鱼原代肝细胞建立了一种检测环境雌激素的方法，并将其应用于猪肉不同加工方式产生的未知雌激素的筛查。本文可为未来雌激素的检测及筛查提供一种参考，但进一步应用需待后续研究支持。