冷适蛋白酶在低温下有较高的催化活性,在食品、化工、医药等领域具有潜在的应用价值,其研究已受到国内外的广泛重视。本文从中国冰川1号雪山微生物样本中筛选获得1株能够产冷适蛋白酶的耐冷菌Bacillus cereus SYP A2-3,并系统开展了发酵产酶、分离纯化和酶学性质等多项研究,为深入开发我国冷适微生物资源提供了素材,并在适冷机制的理论研究方面,提出了一些有价值的观点。SYP A2-3是一株革兰氏阳性芽孢杆菌,能在0-38℃范围内生长,最适生长温度在25℃,最大NaCl耐受浓度8%,能够利用多种碳源和氮源,VP反应、触酶实验、明胶液化实验、M-R实验呈阳性。实验测定了该株菌的16s rDNA,在系统发育树中,该菌与Bacillus cereus和Bacillus thuringiensis有较近的亲缘关系,结合表型分类和16s rDNA序列比对结果,将SYP A2-3鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）。产酶条件研究显示,SYP A2-3最适产酶温度15℃,培养基最适初始pH 6.5-7.0,可溶性淀粉、果糖和葡萄糖是较好的碳源,其适宜的浓度是10 g/L,高浓度的糖能够起到代谢阻遏作用。酪蛋白是较好的氮源,其适宜浓度是10-20 g/L。实验系统地对蛋白酶的底物诱导作用和降解产物的阻遏作用进行了研究。氨基酸残基链长35-55的肽类诱导产酶能力最强,而小分子氮源能够阻遏蛋白酶的形成,因而氮源对蛋白酶合成的诱导和阻遏的双重调节功能与肽链长度有关。对粗料氮源,通过预水解可以提高培养基中α-氨基氮水平,起到促进菌体前期生长作用,能够较大幅度提高其蛋白酶产量,如预水解后的豆粕产酶增加了1100 U/mL,这一机制可能应用于其它蛋白酶的生产调节。鉴于冷适微生物最适生长温度和产酶温度的差异,实验研究了变温培养方式。在近于最适温度下进行细胞培养可缩短培养时间,获得较高的菌体浓度。采用摇瓶方式,20℃预培养16 h比15℃恒温发酵产酶提高28.2%。综合应用变温培养、pH流加控制、氮源补加和产酶保护等控制策略,在5L小罐发酵产酶为4840 U/mL,其产酶高峰在45 h,提前了5-8 h。采用超滤和分级盐析操作能够有效去除杂蛋白,超滤浓缩实现75.3%的回收率,分级盐析酶活回收率达到56.0%。应用离子交换（DEAE fastflow）、凝胶层析（Superdex G75）实现了Bacillus cereus Neutral Protease （BcNP）的分离和纯化。严格的低温操作、快速的纯化方式和全程的酶蛋白保护措施是BcNP纯化技术的关键。BcNP分子量为34.2 kDa,pI为4.8-5.0。以酪蛋白为底物,其最适催化温度为42℃,最适pH范围为7.0-8.5。Ca²⁺、Mn²⁺对其有一定的激活作用,Cu²⁺、Pb²⁺、Co²⁺对活性有一定的抑制,该酶不受丝氨酸型蛋白酶抑制剂PMSF的抑制,但受EDTA强烈抑制,具有金属蛋白酶典型特性。BcNP冷适性表现在三点:一是最适催化温度在40℃左右,低于中温酶近10℃;二