论文部分内容阅读
鸭疫里氏杆菌（Riemerellaanatipestifer,RA）病是由鸭疫里氏杆菌引起家鸭、火鸡、鹅和其它多种禽类的一种接触性传染病，又名称鸭传染性浆膜炎；感染鸭表现主要临床症状是精神沉郁、共济失调、角弓反张和淡绿色下痢等；病理变化主要有纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎、脑膜炎、结膜炎、关节炎和败血症等。该病的发病率和死亡率很高，血清型众多，而各个血清型之间缺乏免疫保护，给该病的防治工作带来困难，已对养鸭业造成了巨大的经济损失。从黑龙江、山东和广东疑似RA感染的鸭场分离到4株细菌，经菌落形态观察、染色镜检、生化鉴定确定为RA，分别命名为HLG1、SD0901、SD0902和GD0901；利用平板凝集试验对RA进行血清型鉴定，其中HLG1、SD0901和GD0901是血清1型菌株。药敏试验表明，4株分离菌株对嗯诺沙星、氧氟沙星和先锋霉素V相对敏感，但对卡那霉素和庆大霉素均耐药。PCR扩增了RA的外膜蛋白A（OmpA）基因，克隆测序结果显示，4个RA分离株的ompA基因全长均为1164bp，编码387个氨基酸，在核苷酸水平上的同源性为89%~100%。将HLG1分离株5×108CFU，颈部皮下接种SPF鸭，病死的SPF鸭的心、肝、脾、肺、脑和肾具有典型的病变，并在人工感染鸭的组织中分离到RA细菌。根据RADSM15868株（登录号为NC014738）全基因组序列设计了3对引物，PCR成功的扩增了HLG1株编码的脂蛋白（Riean0791）、外膜脂蛋白（Riean1110）和外膜脂蛋白（Riean1852）的目的基因，克隆至pMD18-T载体中测序结果表明，Riean0791、Riean1110和Riean1852基因的ORF分别为1404bp、1437bp和1374bp。分别将Riean0791、Riean1110和Riean1852基因克隆到pPRO-EX-Htb载体构建原核表达质粒，转化至大肠杆菌BL21（DE3）plysS感受态细胞后，经IPTG诱导和SDS-PAGE分析结果表明，重组蛋白Riean0791、Riean1110和Riean1852的分子量分别约为55ku、56ku和54ku，均以包涵体形式的表达。Westernblot结果证实，重组蛋白Riean0791、Riean1110和Riean1852均与RA阳性血清发生特异性反应，具有很好的抗原性。纯化的重组蛋白Riean0791、Riean1110和Riean1852作为免疫原对SPF鸭进行了免疫试验证实，两次免疫后，Riean0791、Riean1110和Riean1852免疫组的SPF鸭均产生了较高水平的抗体；对HLG1株的免疫保护率分别为5/6、0/6和2/6。提取HLG1株外膜蛋白，利用制备的Riean0791、Riean1110和Riean1852的血清Westernblot证实，Riean0791、Riean1110和Riean1852蛋白主要位于细菌的膜蛋白中。以纯化的Riean0791蛋白为致敏抗原，初步建立了检测RA血清中的特异性抗体的乳胶凝集试验。对乳胶凝集试验的条件进行优化的结果表明，最佳羧化乳胶浓度为1%，最佳偶联蛋白初始量为200μg，最佳偶联时间为6h。以最佳条件制备的乳胶凝集试剂可与RA阳性鸭血清出现肉眼可见的较强的凝集反应；与PBS、BBS、鸭阴性血清、鸭大肠杆菌、鸭多杀性巴氏杆菌、鸭肠炎病毒和鸭肝炎病毒等阳性血清均无凝集反应，建立的乳胶凝集试验具有较强的特异性、敏感性和重复性。该建立的RA的乳胶凝集试验与OmpA间接酶联免疫吸附试验的符合率为91.04%。本研究中RA的分离鉴定和建立的乳胶凝集试验，为临床鸭群RA的检测提供了一种快速的诊断方法，也可为更好地预防和控制RA提供技术保障。