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第一章壳聚糖/二氧化硅/羟基磷灰石3D杂化材料的制备及其局部免疫反应性[目的]制备壳聚糖-二氧化硅(CS-SIO2)和壳聚糖一二氧化硅-羟基磷灰石(CS-SIO2-HA)3D杂化材料;对比分析CS-SIO2及CS-SIO2-HA杂化材料的体内免疫反应性。[方法]制备壳聚糖-二氧化硅(CS-SIO2)和壳聚糖-二氧化硅-羟基磷灰石(CS-SIO2-HA)前驱混合液,采用3D-BioprinterTM系统打印,分别获取CS、CS-SIO2和CS-SIO2-HA杂化材料,自然干燥或冷冻干燥。切割材料(0.1x0.1x0.2cm3),无菌条件下植入C57BL/6小鼠腓肠肌内。以腓肠肌钝性分离后直接缝合小鼠为对照。分别于植入术后14d、28d、42d、56d摘取包含植入物的肌组织,做冰冻切片,通过HE染色或免疫荧光检测分析植入物诱发的局部炎性渗出特征。[结果]采用溶胶-凝胶(sol-gel)工序及3D生物打印技术,成功构建CS-SIO2及CS-SIO2-HA杂化材料。电镜观察可见两种材料几何结构均匀,纳米级硅粒及羟基磷灰石颗粒散布于壳聚糖表面。组织学检测及免疫荧光观察证实,肌内植入的CS-SIO2及CS-SIO2-HA杂化材料能迅速触发植入物局部的单核(CD11b+)/巨噬细胞(F4/80+)渗出,炎性渗出于植入术后2月内基本消退。较之冻干材料,自然干燥杂化物诱发的炎性反应更为显著,材料周边同时出现树突状细胞(CD11c+)及CD3+CD4+T细胞聚集。[结论]CS-SIO2及CS-SIO2-HA3D杂化材料植入体内后,能诱发局部炎性渗出,但炎性反应在短期内迅速消退。较之自然干燥,冻干杂化物诱发的局部炎症反应更为短暂,具有更佳的体内相容性。第二章壳聚糖/二氧化硅/羟基磷灰石3D杂化材料触发移植部位肌组织的损伤和再生[目的]分析壳聚糖-二氧化硅(CS-SIO2)及壳聚糖-二氧化硅-羟基磷灰石(CS-SIO2-HA)杂化材料是否触发植入部位肌组织的损伤和再生。[方法]将 0.1x0.1x0.2cm3 的 CS-SIO2及 CS-SIO2-HA 杂化材料植入 C57BL/6 小鼠腓肠肌,以腓肠肌钝性分离后直接缝合小鼠为对照。分别于植入术后14d、28d、42d、56d摘取包含植入物的肌组织,冰冻切片,通过HE染色、Masson染色以及Dystrophin免疫荧光染色分析植入物邻近肌组织的溃变坏死情况、基质纤维化程度以及肌纤维的再生过程。[结果]HE及Masson染色结果表明,CS-SIO2及CS-SIO2-HA杂化材料均有一定程度的肌毒性,导致植入物邻近肌细胞坏死。随着植入时间延长,植入材料周边基质中纤维成分显著增加。较之CS-SIO2,CS-SIO2-HA杂化材料在炎性区诱发更为严重的胶原聚集。此外,冻干杂化物诱发的肌坏死及纤维化较自然干燥杂化物更为显著。Dystropin染色观察进一步证实,溃变的同时肌纤维开始再生。随着肌内炎症消退,损伤肌组织的再生修复高效进行,于植入后2月内完成肌修复。[结论]CS-SIO2及CS-SIO2-HA杂化材料均有一定的体内毒性作用,可诱发植入物邻近组织发生坏死和纤维化,随着材料不断降解,肌内炎症消退,肌再生启动,肌纤维进行有效修复。于CS-SIO2杂化材料中添加HA,或采用冻干技术,均会影响杂化材料的体内相容性。第三章壳聚糖/二氧化硅/羟基磷灰石3D杂化材料诱发的全身免疫性分析[目的]分析体内植入的壳聚糖-二氧化硅(CS-SIO2)及壳聚糖-二氧化硅-羟基磷灰石(CS-SIO2-HA)3D杂化材料是否诱发全身性免疫反应。[方法]将 0.1x0.1x0.2cm3 的 CS-SIO2及 CS-SIO2-HA 杂化材料植入 C57BL/6 小鼠腓肠肌,以腓肠肌钝性分离后直接缝合小鼠为对照。分别于植入术后14d、28d、42d、56d摘取小鼠脾脏并分离脾细胞,或无菌条件下眼眶采血。流式细胞术分析脾脏中T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞的数量差异,以及酶联免疫吸附试验检测外周血中补体C3的激活情况。[结果]FACs分析表明,肌内植入的CS-SIO2及CS-SIO2-HA杂化材料的降解成分仅能诱发脾脏内单核/巨噬细胞数量增加,T/B淋巴细胞、树突状细胞的数量并未发生改变。ELISA分析证实,受体鼠的血浆中补体C3水平呈现植入术后早期快速上调,随后下调的趋势。冻干杂化材料诱导的C3上调及持续时间较自然干燥材料更为显著。[结论]小鼠对CS-SiO2和CS-SIO2-HA3D杂化材料降解成分并不易感,难以触发持续的全身性免疫反应。