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目的通过运用RNA干扰技术下调泛素连接酶Ring2基因的表达水平,探讨Ring2在苯并[a]芘致人支气管上皮细胞DNA损伤及组蛋白H2A单泛素化中的作用。方法取对数生长期16HBE细胞,在RNA干扰泛素连接酶Ring2基因前后,分别进行不同浓度B[a]P(0,1,2,4,8,16,32μmol/L)染毒24h;同一浓度(2,8,16μmol/L) B[a]P染毒不同时间(0,1,2,4,8,12,24h)以及同一浓度(2,8,16μmol/L) B[a]P染毒2h后恢复不同时间(0,1,2,4,8,12,24h)实验,用单细胞凝胶电泳实验检测细胞DNA损伤水平,并以Olive尾距值(Olive Tail Moments,OTM)评价DNA损伤程度;用WESTERN-BLOT法检测组蛋白H2A单泛素化水平。结果ⅠRNA干扰前1、单细胞凝胶电泳结果显示:不同浓度B[a]P染毒24h时,随着染毒剂量的升高,各组细胞DNA损伤程度增强,且与对照组相比有统计学意义(P<0.01);同一浓度(2,8,16μmol/L) B[a]P染毒不同时间时,随着染毒时间的延长,各组细胞DNA损伤程度增强,且与对照组相比有统计学意义(P<0.01);2μmol/L B[a]P染毒2h后恢复不同时间时,随着恢复时间的延长,OTM逐渐下降,且在恢复2h后,差异有统计学意义(P<0.01);8μmol/LB[a]P染毒2h后恢复不同时间时,与对照组相比,恢复1h时OTM值略升高,但无显著性差异,恢复2h时OTM值开始下降,但无显著性差异,随着恢复时间的延长,各组细胞OTM值下降明显,差异有显著性(P<0.01);16μmol/LB[a]P染毒2h后恢复不同时间时,与对照组相比,恢复1h时OTM值有显著性升高(P<0.01),随着恢复时间的延长,各组细胞的OTM值显著性下降(P<0.01)。2、WESTERN-BLOT结果显示:不同浓度B[a]P染毒24h时,随着染毒浓度的增高,组蛋白H2A单泛素化表水平增高,且与正常细胞组相比,各染毒组都有显著性差异(P<0.01);2μmol/L B[a]P染毒不同时间时,随着染毒时间的延长,组蛋白H2A单泛素化水平增高明显,与对照组相比,染毒2h后差异有统计学意义(P<0.01);8μmol/L B[a]P染毒不同时间时,随着染毒时间的延长,组蛋白H2A单泛素化水平增高明显,与对照组相比,各染毒组差异都有统计学意义(P<0.01);16μmol/L B[a]P染毒不同时间时,随着染毒时间的延长,组蛋白H2A单泛素化水平增高明显,与对照组相比,染毒4h后差异有统计学意义(P<0.01);2μmol/LB[a]P染毒2h后恢复不同时间时,与对照组相比,各染毒恢复组细胞组蛋白H2A泛素化水平增高,差异有显著性(P<0.01),且在8h处达到最大值;8μmol/LB[a]P染毒2h后恢复不同时间时,与对照组相比,各染毒恢复组细胞组蛋白H2A泛素化水平增高,差异有显著性(P<0.01),且在8h处达到最大值;16μmol/LB[a]P染毒2h后恢复不同时间时,与对照组(恢复0h)相比,恢复1h时H2A泛素化水平略有增高,差异无显著性,恢复2h时增高明显(P<0.05),其余各染毒恢复组H2A泛素化水平增高明显,差异有显著性(P<0.01),且在8h处达到最大值。3、回归分析不同浓度的B[a]P染毒细胞24h组的H2A单泛素化水平(X)与OTM值(Y)有相关关系,且相关的回归方程符合Cubic模型:Y=5.251-278.807X~2+736.392X~3(R~2=0.910 P<0.01);2μM B[a]P染毒不同时间组的H2A单泛素化水平(X)与OTM值(Y)有相关关系,且相关的回归方程符合Cubic模型:Y=2.306-38.713X+209.283X~2-234.211X~3(R~2=0.723 P<0.05);8μM B[a]P染毒不同时间组的H2A单泛素化水平(X)与OTM值(Y)有相关关系,且相关的回归方程符合Exponential模型:Y=Exp(0.085+11.476X) (R~2=0.77 P<0.01);16μM B[a]P染毒不同时间组的H2A单泛素化水平(X)与OTM值(Y)有相关关系,且相关的回归方程符合Cubic模型:Y=13.269-169.591X+669.054X~2-625.192X~3(R~2=0.944 P<0.01);2μM B[a]P染毒2h后恢复不同时间组的H2A单泛素化水平(X)与OTM值(Y)有相关关系,且相关的回归方程符合Linear模型:Y=1.574-2.753X~3(R~2=0.603 P<0.05);8μM B[a]P染毒2h后恢复不同时间组的H2A单泛素化水平(X)与OTM值(Y)有相关关系,且相关的回归方程符合Cubic模型:Y=7.353-21.907X+41.582X~3(R~2=0.503 P<0.05);16μM B[a]P染毒2h后恢复不同时间致组的H2A单泛素化水平(X)与OTM值(Y)有相关关系,且相关的回归方程符合Cubic模型:Y=6.852-23.601X+58.494X~3(R~2=0.750 P<0.05)。ⅡRNA干扰序列刷选转染效率及基因沉默效率结果:16HBE以50nmol/LsiRNA转染6h后,分别培养24h和30h组,与序列对照组相比,各Ring2干扰组Ring2表达水平降低明显,且差异都有统计学意义(P<0.01),在培养30h时,对Ring2基因的抑制率最高且达到72%。ⅢRNA干扰后1、单细胞凝胶电泳结果显示:不同浓度B[a]P染毒24h时,随着染毒剂量的升高,各组细胞DNA损伤程度增强,且与对照组相比有统计学意义(P<0.01);同一浓度(2,8,16μmol/L) B[a]P染毒不同时间时,随着染毒时间的延长,各组细胞DNA损伤程度增强,且与对照组相比有统计学意义(P<0.01);2μmol/L B[a]P染毒2h后恢复不同时间时,随着恢复时间的延长,OTM逐渐下降,且在恢复2h后,差异有统计学意义(P<0.01);8μmol/LB[a]P染毒2h后恢复不同时间时,与对照组相比,随着恢复时间的延长,各组细胞OTM值下降明显,差异有显著性(P<0.01);16μmol/LB[a]P染毒2h后恢复不同时间时,与对照组相比,恢复2h后各组细胞的OTM值显著性下降(P<0.01)。2、WESTERN-BLOT结果显示:不同浓度B[a]P染毒24h时,随着染毒浓度的增高,组蛋白H2A单泛素化表水平变化不明显,且与正常细胞组相比,各染毒组都无显著性差异;同一浓度(2、8、16μmol/L)B[a]P染毒不同时间时,随着染毒时间的延长,组蛋白H2A单泛素化水平变化不明显,与对照组相比,各染毒组差异无统计学意义;同一浓度(2、8、16μmol/L)B[a]P染毒2h后恢复不同时间时,与对照组相比,各染毒恢复组细胞组蛋白H2A泛素化水平变化不明显,各染毒组差异无显著性。3回归分析显示,各组H2A单泛素化水平(X)与OTM值(Y)无相关关系。Ⅳ协方差分析显示,在泛素连接酶Ring2降低表达之后,各组染毒B[a]P所致的DNA损伤比Ring2正常表达时更严重,且差异有统计学意义(P<0.01)。结论1、B[a]P引起的细胞DNA损伤存在剂量效应与时间效应关系。2、B[a]P引起的DNA损伤与组蛋白H2A的单泛素化修饰存在密切关系。3、泛素连接酶Ring2在B[a]P致DNA损伤诱发的组蛋白H2A的单泛素化修饰中发挥重要作用。