目的:运用形态学观察方法及基因芯片检测的大数据分析方法,观察和分析体外构建的组织工程神经体内修复周围神经缺损过程中血管生成的自然生物学过程,并研究和探讨其血管生成关键调控基因和内在分子调控机制。方法:1.体外构建组织工程神经。成功制备冷冻干燥的壳聚糖神经导管的基础上;以大鼠皮肤来源祖细胞(SKPs)分化的施万细胞(SKP-SCs)为支持细胞,内置丝素纤维的壳聚糖导管为支架材料,在旋转灌注式细胞培养系统(RCCS)中体外构建组织工程神经。构建好的组织工程神经用生理盐水(NS)漂洗两次,于NS中保存备用。2.制备坐骨神经缺损模型。SPF级雌性SD大鼠随机分为4组:TENG(组织工程神经)组,Autograft(自体神经)组,Scaffold(壳聚糖神经导管)组,Sham(假手术)组。实验设1d、4d、1w、2w、3w、4w、8w和12w共8个时间点。常规手术制备大鼠坐骨神经10mm缺损模型。3.体视显微镜观察和拍照。动物麻醉后,游离并充分暴露桥接的组织工程神经或自体神经(每个时间点:TENG组n=3,Autograft组n=3)。组织工程神经或自体神经整体置于体视显微镜视野内进行观察,聚焦其表面血管进行拍照。4.HE染色和拍照。体视显微镜拍照完毕后,取出手术侧组织工程神经及桥接段自体神经(每个时间点:TENG组n=3,Autograft组n=3)。动物标本经过固定、切片,进行HE染色。光镜下对组织工程神经和自体神经中段的内部血管进行观察和拍照。5.Micro-CT扫描、血管重建及参数分析。动物麻醉后,进行MICROFIL造影剂灌注(术后4w:TENG组n=3,Autograft组n=3)。造影剂固化后,分离并取出手术侧组织工程神经及桥接段自体神经。透明处理的组织标本,体视显微镜下观察;选取血管造影剂灌注充分的标本进行Micro-CT扫描、血管图像重建及参数分析。6.基因芯片检测及大数据分析。动物麻醉后,快速分离并取出各组手术侧桥接段组织(Sham组为相同部位坐骨神经)(术后各时间点:TENG组n=9,Autograft组n=9,Scaffold组n=9,Sham组n=9;每组各时间点三只动物标本做成一支混合管)。组织标本进行RNA提取及基因芯片检测。基因芯片数据进行“血管相关”基因分析。7.Real-time RT-PCR检测及数据分析。动物麻醉后,快速分离并取出组织标本(术后各时间点:TENG组n=3,Autograft组n=3,Scaffold组n=3,Sham组n=3;每组各时间点三只动物标本做成一支混合管)。组织标本进行RNA提取、逆转录及关键基因RT-q PCR检测。8.免疫荧光染色和拍照。选取血管出芽生长过程显著时间点(TENG组n=3,Autograft组n=3),挑选其关键调控基因。组织切片进行免疫荧光染色和拍照,关键蛋白与血管内皮细胞共同染色,以定位相互空间关系。结果:1.体视显微镜大体观察表面血管。TENG组术后4d见血管从组织工程神经两端长入,2w血管布满组织工程神经表面;Autograft组术后1w、2w血管明显增多。2.HE染色光镜下观察内部血管。TENG组术后1w管壁内出现成熟血管管腔,2w管壁内血管明显增多;术后1w再生组织内部可见较多血管,2w-12w再生组织内部均可见大量血管。Autograft组术后1d、4d神经组织内部即可见血管,随后数量增多且各时间点无明显变化。3.Micro-CT扫描血管重建。TENG组和Autograft组均可见大量微血管,以及联通近远侧的血管。TENG组血管主要从近侧端、远侧端和中间部分三个方向长入。4.血管重建图像参数量化分析。TENG组和Autograft组相比,平均血管直径TENG组明显小于Autograft组(p<0.05);血管数量、联通性和空间分布等参数无统计学差异(p>0.05)。两组均主要为微血管和毛细血管,TENG组较之Autograft组,血管直径相对较细,但分布范围更广。5.基因芯片数据聚类分析。TENG组、Autograft组和Scaffold组每个时间点三个样本基因表达数值重复性均较好,其中术后1d基因表达数值与其余时间点数值相对独立。6.基因芯片数据主成分分析。TENG组、Autograft组和Scaffold组术后1d为一个阶段,离其余各时间点距离较远;术后4d、1w、2w、3w、4w、8w和12w为第二阶段,相互距离较近。7.基因芯片差异表达基因数目分析。TENG组和Scaffold组上下调差异基因数目,术后1w开始明显增加;Autograft组上下调差异基因数目,术后各时间点变化不大,趋于平稳。TENG组和Scaffold组更为相似,与Autograft组略有不同。8.基因芯片数据生物学过程分析。TENG组、Autograft组和Scaffold组血管生成均包括“缺氧启动”(术后1d)、“血管出芽生长”(术后4d-3w)和“血管重塑”(术后4w-12w)三个大的阶段;TENG组较之Autograft组和Scaffold组,更有利于血管出芽生长(出现时间更早)和血管重塑(持续时间更长)的发生。9.血管生成主要基因维恩图分析。从基因具体参与情况看,Scaffold组细胞缺氧反应较之TENG组和Autograft组更为显著;TENG组和Autograft组血管出芽生长更相近;TENG组(两个时间点)和Scaffold组血管重塑更为显著。10.血管生成关键基因分析。细胞对缺氧的反应,UCN2在TENG组和Autograft组发挥关键作用,PTGS2在Scaffold组发挥重要作用。血管出芽生长,VEGFA和E2F8在TENG组发挥关键作用,SEMA3E在Autograft组发挥重要作用。血管重塑,DBH在TENG组和Scaffold组发挥关键作用,CSRP3在Autograft组发挥重要作用。11.血管生成主要基因动态调控分析。血管出芽生长,较之Autograft组,TENG组和Scaffold组表达变化基因更多;TENG组和Autograft组到后期差异基因开始减少,总体呈现先增加后回落的趋势;Scaffold组到后期差异基因没有明显减少趋势。血管重塑,较之Autograft组,TENG组和Scaffold组表达变化基因更多;Autograft组到后期差异基因开始减少,总体呈现先增加后回落的趋势;TENG组和Scaffold组到后期差异基因没有明显减少趋势。12.Real-time RT-PCR检测分析。血管生成过程中细胞对缺氧的反应、血管出芽生长以及血管重塑的关键参与基因,RT-q PCR检测结果与基因芯片检测结果两者基因随时间变化表达趋势相似,具有较好的相关性。13.免疫荧光染色分析。血管出芽生长过程最为显著的时间点,关键基因VEGFA(TENG组术后4d)、E2F8(TENG组术后1w)和SEMA3E(Autograft组术后2w)均有翻译表达且和血管内皮细胞共定位表达,表明其在血管出芽生长过程中发挥主要作用。结论:1.周围神经再生过程中,血管生成包括“缺氧启动”、“血管出芽生长”和“血管重塑”三个主要阶段。2.组织工程神经和自体神经桥接修复周围神经损伤,新生血管网络没有本质差别;血管生成不同阶段的时相和主要调控分子有所不同。3.皮肤来源祖细胞分化的施万细胞,作为组织工程神经的支持细胞,有利于周围神经再生过程中的“血管出芽生长”和“血管重塑”。